第一章 颗粒细胞中低表达的lncRNADDGC在早发性卵巢功能不全中的作用与机制研究背景早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）是导致生殖障碍最常见的疾病之一,影响约1%的育龄期女性,卵巢功能在40岁前不同程度耗竭是其重要特点。卵巢功能的提前衰退不仅预示着女性生育潜能的显著下降,随之而来的雌激素不足还会增加骨质疏松、心血管疾病等远期并发症患病风险,严重危害女性近远期身心健康。POI的临床表现和病因均具有高度异质性,目前半数以上的POI发病原因依旧不明,导致临床缺乏针对POI的有效诊疗手段。既往POI发病机制研究主要集中于蛋白编码区域,但转录组学的研究已证实人类基因组98%以上的转录产物是非编码RNA,其中一半以上是长非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）。LncRNA 是长度超过 200 个核苷酸的非编码转录产物,能够调控编码基因和蛋白的表达、定位与功能。基于疾病模型的研究发现了 lncRNA在肿瘤发生、代谢异常、免疫紊乱中的重要调控作用。但是lncRNA在卵泡发育及POI发病过程中的调控作用目前知之甚少,探讨lncRNA参与的表观遗传调控是POI病因学研究的新方向之一。目的明确POI患者颗粒细胞内的lncRNA表达模式,并进一步深入探讨差异表达lncRNA在卵泡发育及POI发病中的调控作用与机制,为POI的发病机制探索提供新的表观遗传调控证据,同时为POI的临床诊疗提供研究基础。方法首先收集8例生化异常期POI（bPOI）患者及9例年龄、BMI匹配健康女性的颗粒细胞,进行转录组测序分析发现在POI患者颗粒细胞差异表达的lncRNA;qRT-PCR扩大样本验证测序结果,比较lncRNA表达差异倍数;在人颗粒细胞来源KGN细胞系中沉默lncRNADDGC后进行表达谱测序分析观察DDGC下调对于颗粒细胞整体功能的影响;在KGN、SVOG细胞系中通过功能实验探讨lncRNA DDGC在颗粒细胞增殖、细胞周期进程、DNA损伤修复、凋亡、激素合成等方面的作用;通过核质分离、荧光原位杂交、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、RNA pulldown等实验方法阐明lncRNA DDGC在卵泡发育及POI发病中的调控机制;借助腺病毒在小鼠卵巢过表达DDGC,观察DDGC在体外培养及体内环境下对卵巢功能的调控作用。结果一、LncRNADDGC在bPOI患者的颗粒细胞中显著下调,并在卵巢组织中相对高表达。转录组测序分析发现78个lncRNA显著差异表达。qRT-PCR扩大样本验证显示 lncRNAAC 112721.1、ZNF674-AS1和DDGC 显著下调,lncRNA GS1-358P8.4、SNAI3-AS1和RP11-3D4.3显著上调。其中,lncRNADDGC表达差异倍数最大且在卵巢组织相对高表达。二、LncRNA DDGC通过直接结合miR-589-5p调控RAD51 mRNA的稳定性与颗粒细胞同源重组修复过程。KGN表达谱测序分析结合qRT-PCR验证提示DDGC下调导致颗粒细胞DNA损伤修复通路异常。功能实验发现沉默DDGC导致依托泊苷诱导的KGN和SVOG细胞DNA损伤修复延迟、凋亡增加。进一步研究发现沉默DDGC导致RAD51表达下降,细胞同源重组修复过程受损。RAD51过表达能够挽救DDGC沉默导致的细胞DNA损伤修复延迟,提示RAD51是DDGC调控颗粒细胞DNA损伤修复的关键靶基因。核质分离和RNA荧光原位杂交显示DDGC主要分布于细胞质中。沉默DDGC加速RAD51mRNA降解。RIP实验显示DDGC与Ago2蛋白特异性结合,并且沉默RAD51同样下调DDGC的表达,提示DDGC通过吸附miRNA调控RAD51 mRNA的降解。生物信息学预测结合功能实验发现过表达miR-589-5p下调DDGC和RAD51。双荧光素酶报告实验与RNA pulldown实验证实miR-589-5p与DDGC和RAD51 mRNA 3’UTR互补结合。综上所述,DDGC通过直接吸附miR-589-5p调控RAD51 mRNA的稳定性与颗粒细胞同源重组修复过程。三、LncRNA DDGC通过与HSP90结合调控WT1蛋白稳定性与颗粒细胞分化状态。KGN表达谱测序分析发现多个颗粒细胞雌激素合成相关基因的差异表达,提示DDGC沉默导致颗粒细胞分化异常。功能实验显示沉默DDGC导致颗粒细胞雌二醇合成升高、FSHR和CYP19A1表达上调。进一步研究发现DDGC沉默导致WT1表达下调,且过表达WT1能够逆转DDGC下调对于颗粒细胞分化的影响效应,提示DDGC表达不足通过下调WT1导致颗粒细胞分化异常。进一步机制研究发现沉默DDGC导致WT1蛋白稳定性降低、WT1蛋白泛素化降解增加。RNA pulldown与RIP实验显示DDGC在颗粒细胞内与HSP90直接结合,且抑制HSP90活性同样导致WT1蛋白泛素化降解增加。免疫荧光显示HSP90与WT1在颗粒细胞内共定位。沉默DDGC并不改变HSP90的整体表达,但导致HSP90与WT1在细胞核与细胞质中的结合效率显著降低。综上所述,DDGC通过直接结合HSP90调控WT1蛋白稳定性与颗粒细胞分化状态。四、LncRNADDGC通过上调Rad51促进小鼠卵巢DNA损伤的修复。小鼠卵巢体外培养实验显示过表达DDGC抑制依托泊苷诱导的卵巢DNA双链断裂与凋亡产生,但不影响WT1泛素化水平。体内实验发现,小鼠卵巢包囊注射腺病毒过表达DDGC能够上调卵巢内Rad51的表达,但并不改变WT1、FSHR和CYP19A1的表达。进一步通过腹腔注射依托泊苷诱导小鼠卵巢DNA损伤,发现过表达DDGC显著减少了小鼠卵巢DNA双链断裂及凋亡的产生。以上结果说明DDGC通过上调Rad51促进了小鼠卵巢DNA损伤的修复。结论:LncRNADDGC在颗粒细胞DNA损伤修复与有序分化中具有重要作用。DDGC表达不足导致颗粒细胞RAD51 mRNA和WT1蛋白稳定性下降,造成细胞同源重组修复障碍、凋亡增加和分化异常,最终可能导致卵泡闭锁和POI。第二章颗粒细胞中低表达的lncRNA ZNF674-AS1在早发性卵巢功能不全中的作用与机制研究背景卵泡是由颗粒细胞包绕卵母细胞形成的功能复合体。从始基卵泡形成到最终排卵的整个卵泡发育过程中,颗粒细胞通过细胞连接和旁分泌途径介导卵泡的有序激活、生长和成熟,维持了生理状态下女性的正常生殖功能。颗粒细胞通过提供氨基酸、胆固醇、葡萄糖及糖酵解产物,提高卵母细胞蛋白质合成效率、促进卵母细胞胚胎发育潜能的获得、满足了生长期卵母细胞较高的能量代谢需求。颗粒细胞增殖受限、分化异常、DNA损伤修复缺陷已被证明能够导致卵泡闭锁和POI的发生。因此,颗粒细胞状态与POI发生发展的关系得到越来越多的关注。LncRNA作为功能与调控机制多样的转录产物,参与调控细胞早期发育到最终衰老的整个过程。近期有研究表明某些lncRNA参与维持颗粒细胞的增殖、激素合成等功能,但lncRNA与颗粒细胞状态及POI发生发展的关系依旧缺乏详尽的功能与机制研究。目的基于前一章节的研究基础,继续挖掘POI患者颗粒细胞差异表达lncRNA在卵泡发育和POI发病中的调控作用,并阐明其作用机制,为lncRNA参与的POI发生发展提供新的研究证据。方法在上一章转录组测序与qRT-PCR扩大样本验证的基础上,将lncRNA表达水平与临床常用的卵巢功能评估指标进行了相关性分析;在人颗粒细胞来源KGN、COV434细胞系中利用反义锁核苷酸探针沉默lncRNAZNF674-AS1,通过CCK-8、EdU染色等实验观察ZNF674-AS1对于颗粒细胞增殖的影响;使用相关试剂盒检测颗粒细胞糖酵解醛缩酶活性、糖酵解产物及ATP水平,并通过无葡萄糖培养基诱导细胞代谢压力后检测ZNF674-AS1表达变化,观察lncRNA ZNF674-AS1对于颗粒细胞糖代谢的调控作用。最后,借助核质分离、RNA pulldown、质谱分析、RIP、免疫荧光等技术阐明lncRNAZNF674-AS1的具体调控机制。结果一、LncRNA ZNF674-AS1表达显著下调,并具有卵巢功能相关性。我们在33例bPOI患者和41例年龄、BMI匹配的健康女性颗粒细胞进行qRT-PCR验证,结果显示bPOI患者颗粒细胞内lncRNA ZNF674-AS1的表达显著下调。此外,ZNF674-AS1的表达水平与血清基础雌二醇和AMH水平显著正相关,与血清基础FSH水平显著负相关,说明ZNF674-AS1的表达水平与卵巢储备相关。二、LncRNA ZNF674-AS1在颗粒细胞增殖与糖酵解过程中的作用与机制。功能实验发现沉默ZNF674-AS1导致KGN、COV434细胞的细胞活力与增殖能力显著降低,但不影响雌激素的合成能力。核质分离结合qRT-PCR发现ZNF674-AS1主要分布于细胞质中,提示ZNF674-AS1的转录后调控作用。RNA pulldown结合质谱分析提示ZNF674-AS1与ALDOA蛋白结合。进一步的RIP实验证实了 ALDOA蛋白与ZNF674-AS1的直接结合。沉默ZNF674-AS1不影响ALDOA的表达和亚细胞定位,但导致KGN、COV434细胞单位时间内的ALDOA裂解能力显著下降,ALDOA活性显著降低。沉默ZNF674-AS1导致细胞糖酵解产物果糖-1,6-二磷酸和乳酸浓度显著降低,说明ZNF674-AS1的表达不足抑制了颗粒细胞的糖酵解过程。沉默ZNF674-AS1导致细胞ATP生成减少,ADP/ATP 比例显著升高,说明ZNF674-AS1表达不足导致细胞能量代谢缺陷。此外,葡萄糖缺乏诱导的代谢压力显著上调颗粒细胞ZNF674-AS1的表达。以上结果说明代谢压力响应性ZNF674-AS1是颗粒细胞糖酵解所必需的。三、LncRNAZNF674-AS1通过 ALDOA/v-ATPase 依赖性 AMPK 激活通路调控颗粒细胞增殖。沉默ZNF674-AS1导致颗粒细胞AMPK及其下游ACC蛋白的磷酸化水平明显升高,说明ZNF674-AS1表达不足诱导AMPK的激活。AMPK的异常激活同样抑制颗粒细胞的细胞活力与增殖能力,提示ZNF674-AS1表达下调可能通过激活AMPK抑制颗粒细胞增殖。免疫共沉淀实验发现沉默ZNF674-AS1促进了ALDOA与v-ATPase非催化亚基ATP6V1B2的结合,且沉默ATP6V1B2显著抑制了 ZNF674-AS1表达不足导致的AMPK异常激活。此外,功能实验同样显示沉默ATP6V1B2可逆转ZNF674-AS1表达不足对于颗粒细胞活力和增殖的抑制作用。综上所述,ZNF674-AS1表达不足通过诱导ALDOA/v-ATPase依赖性AMPK激活,抑制颗粒细胞增殖。结论LncRNA ZNF674-AS1是颗粒细胞增殖和糖酵解所必需的。ZNF674-AS1与ALDOA的直接结合维持了颗粒细胞的糖酵解过程与正常增殖,保证了卵泡的正常发育。