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青霉素类抗生素目前广泛应用于奶牛乳腺炎的预防和治疗，如果滥用、使用不当或不遵守休药期规定，均可造成此类抗生素残留。残留在牛奶中的抗生素，不仅会影响牛奶的品质，甚至会危害人体健康，抗生素残留已经成为国际贸易的绿色壁垒。动物源性食品中抗生素残留的前处理及检测技术日益受到国际社会的重视，而抗生素的多残留同时提取检测的研究显得尤为重要。本研究旨在采用青霉素类抗生素中间体6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanicacid，6-APA)为虚拟模板，制备青霉素类（PENs）的新型分子印迹固相萃取柱，从复杂基质的生物样品中同时提取残留的多种青霉素：青霉素G钾(penicillin G，PEN)、氨苄青霉素(ampicillin，AMP)和阿莫西林(amoxicillin，AMO)及中间体6-APA，并用高效液相色谱进行同时分离检测，建立一种6-APA分子印迹固相萃取-高效液相色谱的检测方法（MISPE-HPLC），为含复杂基质样品中痕量分析物的检测提供了新型的样品前处理及检测技术。同时建立了检测该4种药物的超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）的检测技术，为以后作进一步研究打下基础。具体研究内容如下：16-APA分子印迹聚合物以及分子印迹固相萃取柱的制备以青霉素母核6-APA为模板分子、α-甲基丙烯酸为功能单体(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂(EDMA)、引发剂（AIBN）（聚合比例为1:5:30:0.3），并以甲酸作为致孔剂采用沉淀聚合法制备非共价印迹聚合物，并利用红外光谱和扫描电镜对该非共价印迹聚合物的结构和形貌进行表征，采用静态吸附实验研究此印迹聚合物的吸附性能。Scachard分析表明：此印迹聚合物对3种模板分子类似物-AMO、PEN、 AMP具有较大的表观吸附容量。用制备好的分子印迹聚合物作为吸附剂同硅藻土以2:1的比例装填入空的SPE柱中，制备成分子印迹固相萃取柱（MISPE）。并通过考察不同活化剂和洗脱剂对MISPE柱的影响，选择最佳活化剂和洗脱剂，方法的回收率均83.5%~87.27%之间。24种PENs高效液相色谱方法的建立建立了高效液相色谱(HPLC)同时检测牛奶中青霉素类抗生素中间体6-APA及3种青霉素类药物：氨苄青霉素(AMP)、阿莫西林(AMO)和青霉素G钾(PEN)的方法。用Xterra MS C18柱，考察了不同流动相的种类和配比对分离效果的影响，确立以乙腈-0.1%氨水（5:95）为流动相，检测波长为200nm。6min内可实现4种青霉素类抗生素（PENs）的快速分离检测。方法在0.125~10mg/L范围内有良好的线性，相关系数为r2=0.9972~0.9993，相对标准偏差(RSD，n=6)为2.01％～2.22％。34种PENs高效毛细管电泳方法的建立建立了高效毛细管电泳(HPCE)同时检测牛奶中青霉素类抗生素中间体6-氨基青霉烷酸(6-APA)以及3种青霉素类药物青霉素G钾(PEN)、氨苄青霉素(AMP)和阿莫西林(AMO)的方法。利用正交实验设计，对HPCE中的缓冲液离子浓度，pH值，分离电压，分离温度等分离条件进行了优化。确立了以40mmol/L磷酸二氢钾-20mmol/L硼砂为电泳缓冲液(pH7.8)，分离电压为28kV，分离温度为30℃，4.5min内可实现4种青霉素类药物(PENs)的快速分离检测。各组分在1.56～100mg/L范围内有良好的线性，相关系数r2为0.9979～0.9998，相对标准偏差(RSDs)为1.20%～1.93%(n=6)。可用于分子印迹聚合物制备过程中的检测。46-APA MISPE-HPLC检测方法的建立以制备的6-APA MISPE柱为对象，考察了MISPE柱活化溶剂的种类，洗脱剂的种类和用量对样品中6-APA以及模板类似物回收率的影响。建立了以10mL3.2g/L溴化四丁基铵乙腈提取，并以3mL80%甲醇水溶液作为活化溶剂，以3mL乙腈-甲醇（v:v=3:7）作为洗脱剂进行净化的前处理方法，方法的回收率均在83.5%～87.27%之间。将牛奶中青霉素类药物最佳的前处理方法与高效液相色谱检测方法联用，确立了牛奶中青霉素类抗生素6-APA MISPE-HPLC的检测方法。研究结果表明：建立的MISPE-HPLC方法选择性好，精密度、准确度高。建立的4min内同时测定4种PENs的高效液相色谱方法简便、快速、易行。对于检测牛奶及动物源性食品中兽药的残留检测新方法的创建具有非常重要的探索性意义和实用意义。5UPLC-MS/MS方法的建立超高效液相色谱条件的建立：应用Agilent Cl8(2.1x150mm，5μm)色谱柱，分别比较了不同流动相配比情况下对4种物质分离效果的影响，最终确定流动相配比为：75%水-25%乙腈时分离效果最佳。质谱条件的建立：电喷雾离子源(ESI)；离子化模式：负离子扫描模式；毛细管电压：4000V；雾化气压力：35psi；干燥气流量：9.5L/min；干燥气温度：350℃。质谱为MRM模式，碰撞气为高纯氮气。根据4种药物的分子结构来确定毛细管出口电压和碰撞能量。通过优化传输电压找到4PENs的母离子，并进一步优化碰撞电压，分别找到每个母离子的特征子离子，确定定量离子。各物质在0.15~5mg/L范围内有良好的线性，相关系数r2为0.9992～0.9995，4PENs的检出限（LOD）均为0.02mg/L，定量限（LOQ）均为0.05mg/L。