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研究背景缺血性心脏病(Ischemia heart disease, IHD)导致的心力衰竭(Heart failure, HF)呈逐年递增趋势,如果没有得到及时有效的治疗,则会出现大量心肌细胞的变性和坏死,导致严重的后果和各种并发症的发生,严重威胁着人类的生存及生活质量。成年心肌细胞是高度分化的终末细胞,损伤后不能再生。一旦大部分心肌组织受损,目前的治疗药物只能延缓其病情的发展但无法根治和修复终末期心衰,心脏移植是目前有效的治疗方法但因供体来源有限及费用昂贵而不能广泛应用于临床,因此探索新的治疗手段成为研究人员追寻的目标。心肌细胞移植是近年来治疗缺血性心脏病的热点,发展迅速。此后,心肌组织工程的诞生与兴起,为治疗缺血性心脏病带来曙光,使再造有功能的心肌组织有了希望,也成为心肌组织工程领域最富有挑战性的目标。目前,心肌组织工程的研究已取得了很大的进展,国内外有关此方面的报道也日益增多,必将为治愈这一心脏顽疾奠定坚实的基础。研究目的1.观测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为心肌样细胞的作用及分化率。2.探索聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)共聚物支架和BMMSCs诱导分化的心肌样细胞体内构建工程化心肌组织的可行性及效果。研究方法1. AngⅡ联合5-aza体外诱导BMMSCs分化为心肌样细胞:采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第3代BMMSCs进行分组诱导: AngⅡ联合5-aza组(0.1μmol/L与10μmol/L)、AngⅡ组(0.1μmol/L)、5-aza组(10μmol/L)、空白对照组。诱导24 h后更换常规培养液继续培养4 w。倒置相差显微镜下观察细胞的形态学变化,MTT法检测细胞增殖能力,免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白I (cTnI)的表达,流式细胞计数法检测心肌样细胞诱导率,透射电镜观察心肌样细胞的超微结构。2.PLGA共聚物与BMMSCs诱导分化的心肌样细胞体内构建工程化心肌组织:PLGA共聚物剪成方片形状,经60Co照射消毒、PBS及DMEM水化后备用。将诱导成功后的心肌样细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的PLGA共聚物上,形成细胞-支架复合物,置于细胞培养箱中培养3 d,然后移植到大鼠腹腔囊袋中。4 w后,采用HE染色、免疫组织化学染色、扫描电镜及透射电镜观察体内构建的工程化心肌组织的形态和结构。研究结果1.原代培养的BMMSCs14 d形成集落,传代细胞体积变大,诱导后细胞呈长梭形均匀一致生长,并出现肌岛样结构。MTT法显示:AngⅡ联合5-aza组、AngⅡ组、5-aza组、对照组在第5 d的光吸收值分别为0.209±0.044,0.148±0.009、0.129±0.012、0.103±0.008,第7 d分别为0.284±0.014、0.224±0.010、0.220±0.009、0.169±0.019,AngⅡ联合5-aza组细胞增殖能力优于AngⅡ组或5-aza组(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs表达心肌特异性蛋白cTnI。流式细胞计数法显示:AngⅡ联合5-aza组、AngⅡ组、5-aza组及对照组的心肌样细胞诱导率分别为(30.0±1.7) %、(25.3±2.2) %、(24.6±1.9) %、(0.8±0.2)%,AngⅡ联合5-aza组心肌样细胞诱导率高于AngⅡ组或5-aza组(P<0.05)。透射电镜可见肌丝、Z线样物质。2.HE染色显示心肌样细胞在工程化心肌组织中均匀分布,细胞核呈长梭形。免疫组织化学染色示体内构建的工程化心肌组织cTnI阳性。扫描电镜可见接种的细胞与PLGA粘附良好,且细胞在构建物中呈三维化生长。透射电镜显示,构建的工程化心肌组织含有排列整齐的肌原纤维,沿细胞长轴平行分布,细胞富含线粒体和内质网,还可见到桥粒结构、缝隙连接及Z线样物质。研究结论1. AngⅡ联合5-aza可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率高于单纯5-aza诱导(P<0.05)。2.以PLGA共聚物为支架、BMMSCs诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,于体内可构建出形态结构类似于天然心肌组织的工程化心肌组织。