研究背景及目的子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）是指功能性子宫内膜腺体及间质在宫腔外异位种植的疾病,可广泛累积女性生殖系统,包括子宫、卵巢、输卵管、盆腔等器官[1]。目前它的发病机制尚不明确,主要学说包括:异位种植学说（也称为经血逆流学说）、在位内膜决定论、体腔上皮化生学说和诱导学说、干细胞学说、遗传因素、免疫因素及环境因素和生活方式等[2]。EMs作为一种常见的妇科疾病,可引起女性痛经、性交痛、不孕及慢性盆腔痛,对育龄期妇女的生殖健康产生了严重的不良影响。据报道,EMs中40%-60%有不孕,不孕症中约25%-40%为EMs,因此2000年国外学者首次提出“endometriosis-associated infertility”这一全新概念,即“子宫内膜异位症性不孕症”[3,4]。该病的临床治疗包括药物和手术治疗及辅助生殖技术,但存在费用高、妊娠率低等问题,严重降低患者的生活质量并影响其家庭生活。近年来,EMs发病率呈现上升趋势,已成为全球关注的重大公共卫生问题。就其根本原因在于EMs不孕的发生机理尚不清楚,难以从根本上解决此类患者的生殖健康问题。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转变的现象,在此过程中,细胞经历细胞骨架重构后失去细胞极性、黏合连接、细胞桥接,由此获得迁移和侵袭能力等间质细胞特征[5-7]。以往研究发现,EMT和纤维化在内异症的发生中扮演重要角色,具体表现为子宫内膜上皮细胞的EMT促进内异症局部炎症损伤、修复、纤维化、细胞侵袭和转移;同时上皮细胞获得间质细胞样侵袭和运动能力,使得内异症虽为良性疾病却有恶性肿瘤侵袭和转移的特性。晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products,AOPPs）是体内蛋白质氧化终末期产物,可诱导EMT及纤维化发生,是许多慢性疾病的发病机制[8-11]。AOPPs在内异症子宫内膜上皮细胞的炎症损伤、修复、细胞侵袭和转移中发挥重要作用[12,13]。课题组前期研究表明,异常增高的AOPPs作为内源性致病物质,诱导体内外模型的子宫内膜上皮细胞增殖、迁移、氧化应激和炎症损伤。提示AOPPs与子宫内膜细胞功能紊乱发生有关,但AOPPs是否参与子宫内膜细胞EMT和纤维化过程,尚不清楚。因此,通过对AOPPs诱导的子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化进行深入研究,对发掘细胞功能紊乱过程中新的影响因子及其作用机制,阐明AOPPs致内异症发病机制提供新的理论依据并发展新的干预途径。本研究拟通过检测AOPPs在EMs中的表达情况,分析其表达与EMT和纤维化指标之间的相关性,并通过体外及动物体内实验,研究AOPPs在EMs的EMT和纤维化过程中的作用及相关分子机制,为进一步阐明AOPPs致EMs发病的机制提供新的理论依据,对寻找干预EMs发病的靶标提供新思路。研究方法一、内异症疾病状态下,AOPPs与EMT和纤维化的关系研究收集20例临床确诊为EMs患者的手术切除的异位子宫内膜标本和在位子宫内膜标本以及20例正常子宫内膜组织标本,利用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测在内异症的疾病状态下,卵巢异位囊肿、在位子宫内膜中AOPPs、EMT、纤维化指标的表达,并以正常妇女的子宫内膜组织做对照。二、AOPPs对子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的影响及机制研究1、AOPPs的制备及浓度测定,将鼠血清白蛋白（Rat Serum Albumin,RSA）与次氯酸钠混合孵育制备AOPPs,后测定AOPPs浓度、蛋白定量及内毒素的含量。2、原代SD大鼠子宫内膜上皮细胞的提取、鉴定及培养,刮取8周龄SD雌性大鼠子宫内膜,经消化、过滤、裂解、过滤等步骤分离出子宫内膜上皮细胞,并采用免疫荧光试验以鉴定所提取细胞的种类和纯度,进行细胞培养。3、外源性补充AOPPs,同时予氧化抑制剂刺激,利用免疫荧光技术及Western blot技术检测子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化指标的变化。4、外源性补充AOPPs后,利用Western blot检测子宫内膜上皮细胞中ERK1/2、P38的表达,同时进行信号通路阻断实验,分析AOPPs调控子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的机理。三、动物实验验证AOPPs在子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化发生中的作用大鼠腹腔注射AOPPs4周、8周、12周后处死大鼠,取出子宫内膜组织,利用IHC检测EMT和纤维化指标,以进一步验证AOPPs介导了子宫内膜上皮细胞的EMT、纤维化过程。研究结果一、AOPPs与EMT和纤维化指标在EMs及正常女性组织中的表达鉴定1、子宫内膜组织中AOPPs与EMT和纤维化指标的表达IHC结果表明AOPPs在EMs组织中表达高,提示AOPPs参与EMs的发病过程,而在EMs组织中EMT相关指标E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调,纤维化相关指标Collagen Ⅰ表达上调、组织中胶原纤维沉积增多,提示EMs与EMT及纤维化的发生有相关性。2、AOPPs的表达和EMT及纤维化指标表达之间的关系对IHC结果做统计分析,发现AOPPs与上皮细胞标志物呈负相关,与间质细胞标志物及纤维化标志物呈正相关,提示AOPPs可能通过EMT途径影响EMs相关纤维化及疾病进展。二、AOPPs对子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的影响及机制研究1、免疫荧光法鉴定所提取的细胞所提取的原代大鼠子宫内膜细胞经细胞经免疫荧光鉴定,结果显示提取细胞表达角蛋白（Pan-Keratin）,波形蛋白（Vimentin）无表达,可认可为子宫内膜上皮细胞。2、AOPPs诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化免疫荧光实验及Western blot结果表明,与对照组相比,AOPPs以浓度和时间依赖方式下调上皮细胞细胞标志性蛋白表达水平,同时上调间质细胞标志性蛋白和纤维化标志性蛋白表达水平,提示AOPPs能诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化改变。3、AOPPs通过激活子宫内膜上皮细胞氧化应激反应诱导EMT的发生Western blot结果表明,与AOPPs组相比,氧化抑制剂预处理后上皮细胞标志性蛋白表达水平上调,而间质细胞标志性蛋白与纤维化标志性蛋白表达下调。上述实验提示氧化抑制剂能抑制AOPPs诱导的子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的发生,从而说明,氧化应激反应参与了AOPPs诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化的过程。4、AOPPs通过激活MAPK通路诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化Western blot结果表明,与AOPPs组相比,AOPPs+MAPK通路阻断剂组上皮细胞标志性蛋白的表达水平上调,而间质细胞标志性蛋白与纤维化标志性蛋白表达下调。上述实验提示MAPK阻断剂能抑制AOPPs诱导的子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的发生,从而说明,MAPK通路介导了AOPPs诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化的过程。三、动物实验验证AOPPs在子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化发生中的作用IHC实验结果表明,与对照组相比,AOPPs处理组大鼠子宫内膜的上皮细胞标志性蛋白的表达水平上调,而间质细胞标志性蛋白与纤维化标志性蛋白的表达下调,进一步证明了 AOPPs可促进大鼠子宫内膜上皮发生EMT和纤维化。结论AOPPs与子宫内膜异位症的EMT及纤维化密切相关;AOPPs可通过激活大鼠子宫内膜上细胞的氧化应激,上调MAPK通路中的p-ERK与p-P38的表达,进而使大鼠子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化,从而促进子宫内膜异位症的发生发展。