【摘 要】
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阿维菌素(Avermectin)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的一种高效、广谱、低毒的农用抗生素,含有8个结构类似的十六元环大环内酯类化合物(A1a、A1b、A2a、A2b
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阿维菌素(Avermectin)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的一种高效、广谱、低毒的农用抗生素,含有8个结构类似的十六元环大环内酯类化合物(A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b),其中B1a组分杀虫活性最高,毒性最低。在医药、农业及畜牧业中具有良好的应用价值和广阔的市场前景。目前,阿维链霉菌的基因组信息已经公布,阿维菌素的生物合成途径也已基本阐明,对其调控机制的研究也在不断深入。该论文通过合成生物学手段成功钓取阿维菌素生物合成基因簇中的聚酮合酶基因aveA1(11,919 bp),改造并构建了该酶的异源表达载体,用不同方法检测了蛋白的表达情况;同时也将阿维菌素的完整生物合成基因簇在异源宿主中进行了表达。研究中获得的有功能的生物合成元件将为研究异源模块与底盘细胞之间的适配性和合成新型化合物提供良好的素材。主要结论如下:1.在前期构建好的含有阿维菌素生物合成基因簇aveA1/A2的cosmid文库基础上,应用Red/ET重组技术成功捕获aveA1,并将硫酯酶(TE)模块及表达所需元件通过Gibson等温组装法装载至大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体上。为了检测大分子量蛋白表达情况,本研究应用双砷染料-四半胱氨酸系统对aveA1+TE在E.coli中的表达情况进行了快速的原位检测,同时用传统Western blot进行复证,结果表明AveA1+TE蛋白在E.coli中成功表达。2.运用Red/ET重组系统将aveA1+TE装载至利用链霉菌噬菌体φC31所建立的整合型载体pSET152上,并置于红霉素启动子(ermE*P1)下,通过接合转移将aveA1+TE成功整合至不同链霉菌的染色体上,为验证aveA1的功能奠定了基础。3.用Red/ET重组技术成功改造包含阿维菌素的完整生物合成基因簇的BAC载体,用大肠杆菌--链霉菌接合转移所需整合酶基因int,以及抗性筛选基因aac(3)Ⅳ等与BAC骨架上的Cmr抗性基因置换,通过接合转移方式将完整的基因簇整合至天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M1146染色体上,对获得的异源表达菌株M1146/BAC进行发酵,通过HPLC检测,进一步LC-MS分析。该论文首次将阿维菌素生物合成基因簇整合至S.coelicolor M1146染色体上,并发酵检测到了阿维菌素的A2b,B2a,A2a,B1a,A1b,A1a 等组分。
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