论文部分内容阅读
羊毛硫细菌素是一类由革兰氏阳性菌核糖体合成，并经翻译后修饰含有羊毛硫氨酸的抗菌肽。羊毛硫细菌素原肽分子中的Ser/Thr经过修饰酶LanM修饰加工形成Dha/Dhb，并在此基础上与Cys结合形成硫醚键，而这种含有特殊硫醚键的氨基酸即为羊毛硫氨酸。因此，修饰酶LanM在羊毛硫细菌素分子的生物合成过程及其发挥抑菌活性上起着至关重要的作用。Bovicin HJ50是本实验室从牛奶样品中分离到的牛链球菌(Streptococcus bovis HJ50)产生的一种新型Ⅱ类羊毛硫细菌素，其分子结构中含有两个硫醚键和一个特殊的二硫键，同时分子内还存在4个未发生任何修饰的Ser/Thr。
本研究着重对bovicin HJ50的修饰酶BovM进行底物特异性研究，了解bovicin HJ50分子中Ser/Thr发生修饰或逃脱修饰的可能原因，揭示BovM修饰底物的规律，为将来更好地开发利用羊毛硫细菌素提供指导依据。为从底物分子的角度考察修饰酶BovM的底物特异性，本研究利用本实验室前期构建的羊毛硫细菌素“半体外生物合成系统(SIVB)”，采用定点突变技术，从原肽中保守氨基酸位点、Ser/Thr距离前导肽的空间距离、Ser/Thr自身/旁侧氨基酸性质、硫醚环/二硫键的破坏等角度构建了不同系列的bovicin HJ50前肽类似物，经过BovM的修饰及其BovT150切除前导肽后，采用化学修饰及质谱分析等手段检测成熟bovicin HJ50类似物中特殊氨基酸的个数和成键方式，从而考察底物分子中对修饰酶BovM的脱水和环化功能起决定性作用的因素及其影响规律；此外还构建了bovicin HJ50系列前导肽或原肽分子替换的嵌合多肽底物，以考察BovM修饰的底物特异性。结果表明，bovicin HJ50原肽中保守氨基酸位点、Ser/Thr距离前导肽的空间距离、Ser/Thr自身性质等因素对BovM的修饰作用影响不大；但是Ser/Thr旁侧氨基酸的性质，尤其是原肽中发生修饰的Thr旁侧带正电荷的Lys对BovM的修饰活性起着重要的作用；对相关环破坏突变体的研究则进一步证明了硫醚键是羊毛硫细菌素发挥抑菌活性所必须的并且起着稳定分子结构的作用；硫醚环被破坏后其修饰情况未发生任何变化，说明bovicin HJ50成熟过程中并不存在修饰水平上的“环保护效应”，但突变体分子结构变得极不稳定且易降解形成截短片段BovA1～21/22。此外对嵌合多肽底物的实验结果表明，BovM具有一定的底物宽泛性，可对不同来源的原肽分子进行修饰并形成硫醚键，从而形成具有抑菌活性的新型羊毛硫细菌素。本研究从底物分子的角度系统地考察了羊毛硫细菌素bovicin HJ50修饰酶BovM的底物特异性，较深入地阐明了底物分子结构对修饰的影响规律，这些结果和规律丰富了我们对羊毛硫细菌素生物合成过程的认识，为羊毛硫细菌素分子的改造优化及开发利用等提供了指导依据。