第一部分慢性鼻-鼻窦炎组织重塑与炎症的相关性研究[研究背景及目的]慢性鼻-鼻窦炎(Chronic rhino sinusitis, CRS)是鼻-鼻窦黏膜的持续性炎症,是临床上多种疾病的总称,人群患病率约15%。按照国人的炎症类型和组织学类型的不同分为伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(CRSwNP)和不伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(CRSsNP),其中根据嗜酸性粒细胞的百分比,又将伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎分为嗜酸性粒细胞性鼻息肉(Eos CRSwNP)和非嗜酸性粒细胞性鼻息肉(non-Eos CRSwNP).对中国人的CRS的免疫学研究发现,CRSsNP和CRSwNP的患者都表现为调节性T细胞(Treg)的功能缺陷和TH1/TH2/TH17的反应增强.CRSsNP主要以TH1反应为主,Eos CRSwNP主要以TH2/TH17反应为主,伴随自然杀伤性T细胞的浸润,而non-Eos CRSwNP占中国人CRSwNP的一半以上,却没有上述炎症表现。大量的研究表明,气道的重塑包括上皮、间质和黏膜下的改变,最终导致气道壁增厚。组织学上以巨噬细胞和淋巴细胞浸润、成纤维细胞增殖、血管形成、结缔组织增多和组织破坏为特征。大量研究表明,这种重塑现象同样存在于CRS中,不同亚型的慢性鼻窦炎表现出不同的组织重塑特征。迄今为止,典型的鼻息肉组织重塑表现为细胞外基质中白蛋白积聚和水肿形成(即假性囊肿)。目前的研究表明这是因为鼻息肉中相对缺乏TGF-β1信号,细胞外基质缺乏胶原的形成。与此相反,CRSsNP以TH1反应为主,伴随高水平的IFN-gamma和活化的TGF-β1信号,以及因此导致的过量的胶原沉积和纤维化形成。然而,对于不同类型的CRS,特别是Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP之间的差别,这种重塑的特征很少见诸报道。此外,组织的重塑是否和炎症类型有关也是一个具有争议的话题。本研究就旨在揭示不同类型的CRS的组织学特征及其与炎症类型之间的关系。具体研究目标1.分析不同类型的CRS组织学特征,及其在各组中的比例。2.分析不同类型CRS的炎症类型。3.研究不同的组织学特征和炎症类型之间的关系,是否有相关性。[研究方法]1.组织学分析①免疫组织化学方法HE染色检测不同类型CRS的组织学特征,按照Hellquist的分类,将CRS分为纤维化型、水肿型、腺体型和不典型型。由于不典型型非常罕见,且组织学体现为肉瘤或恶变的细胞学特征,事实上随访研究并不支持肿瘤的诊断。因此,我们暂不考虑这一型。②分析每种组织学类型在各种CRS中的比例。③Masson染色,分析各种CRS亚型的水肿评分和胶原比例。④免疫组织化学检测TGF-β2, MPO、 HIF-1α、α-SMA、fibronectin、TIMP-4等蛋白的定位、分布和表达量。计数HE染色切片每高倍镜视野下嗜酸性粒细胞个数。⑤连续切片免疫组化染色观察分析MPO阳性细胞与TGF-β2或HIF-1α阳性细胞之间的关系。2.实时定量RT-PCR检测可能与组织重塑有关的细胞因子,转化生长因子TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、低氧诱导因子HIF-1α、肝素结合上皮生长因子heparin-binding epithelial growth factor (HB-EGF),白介素interleukin(IL)-8,嗜酸性粒细胞阳离子蛋白eosinophilcationic protein (ECP),金属基质蛋白酶metalloproteinase (MMP)-2, MMP-7,金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-1and TIMP-4等的mRNA含量。3.相关性分析分析上述有意义的指标间的相关性,判断组织重塑与炎症类型之间的相关性。[实验结果]1.不同类型的CRS的重塑类型①根据Hellquist的分类,CRS基于组织学特征可分为水肿型、腺体增生型、纤维型和非典型型。而非典型型的特征为间质中大而多形性的组织细胞,这一类型非常罕见,因此本文着重研究其他三种类型。②Eos CRSwNP中水肿型最常见[70.8%(51/72)],比例显著高于non-Eos CRSwNP[43.4%(33/76)](P=0.001)和CRSsNP[20.8%(15/72)](P=0.000)。non-Eos CRSwNP水肿型的比例显著高于CRSsNP(P=0.005)。③与此相反,Eos CRSwNP中纤维型比例最少见[12.5%(9/72)],显著少于non-Eos CRSwNP[37.1%(26/70)](P=0.001)和CRSsNP[49.3%(38/77)](P=0.000)。④尽管腺体增生型的比例从Eos CRSwNP[16.7%(12/72)]到non-Eos CRSwNP[20.0%(14/70)]到CRSsNP[29.9%(23/77)]呈递增趋势,但是没有显著性差异。⑤Masson染色发现在Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP中胶原的含量显著低于Controls,而CRSsNP的胶原含量显著高于Controls.尽管在Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP的胶原含量均少于CRSsNP,但是non-Eos CRSwNP的胶原含量显著高于Eos CRSwNP.⑥与此相反,Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP的水肿评分显著高于CRSsNP和Controls;而Eos CRSwNP的水肿评分显著高于non-Eos CRSwNP.2.α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和纤维蛋白原(fibronectin)的表达①a-SMA阳性染色主要分布于间质,在上皮无表达。间质中a-SMA阳性的应力纤维除了血管壁的成分外均被认为是肌成纤维细胞(myofibroblasts)肌成纤维细胞的数目从Eos CRSwNP、non-Eos CRSwNP和CRSsNP呈现递增趋势,但只有Eos CRSwNP和CRSsNP之间存在显著性差异。②纤维蛋白原的表达情况与α-平滑肌肌动蛋白一致。3.生长因子、蛋白酶和蛋白酶抑制剂的表达①我们检测了TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的m RNA水平,发现在各种类型的CRS中,TGF-β1水平均较对照组(Controls)下降；而CRSsNP中TGF-β2的mRNA水平显著高于Eos CRSwNP和Controls; TGF-β3的mRNA水平在几组中无显著性差异。②CRSsNP中HB-EGF的mRNA水平显著高于non-Eos CRSwNP、Eos CRSwNP和Controls.③此外,我们检测了MMP-2、MMP-7、TIMP-1和TIMP-4的mRNA水平。EosCRSwNP和non-Eos CRSwNP中MMP-2的水平显著低于Controls,而MMP-7的水平在CRS各组中均较Controls组上调。而TIMP-4在Eos CRSwNP中的mRNA水平显著低于Controls和CRSsNP; TIMP-1的mRNA水平在各种中无显著差异。④基于上述的mRNA水平的检测,我们进一步检测了鼻黏膜中TGF-β2和TIMP-4蛋白水平的表达,发现TGF-β2和TIMP-4均表达与黏膜的上皮和间质。TGF-β2阳性的细胞广泛分布于各种CRS的间质。而TIMP-4阳性细胞主要分布于腺体细胞和血管和腺体周围的细胞。所有类型的CRS间质中TGF-β2阳性的细胞显著多于Controls,而在CRSsNP中的表达显著多于Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP.但是上皮中TGF-β2的表达在各种中无显著差异。CRSsNP间质中TIMP-4阳性细胞显著多于Eos CRSwNP、non-Eos CRSwNP和Controls;而TIMP-4在Eos CRSwNP的表达显著低于其他组。TIMP-4在各组上皮的表达无显著性差异。4.炎症和组织重塑之间的关系①我们评估了不同类型CRS的炎症类型。相比于Controls, non-Eos CRSwNP和CRSsNP, Eos CRSwNP中嗜酸性粒细胞的数量和ECP的mRNA水平显著上调。与此相反,中性粒细胞(MPO阳性细胞)的数量在所有类型的CRS中显著高于Controls;且中性粒细胞的数量从Eos CRSwNP到non-Eos CRSwNP再到CRSsNP呈现显著的递增趋势。IL-8的mRNA水平在CRSsNP中较其他组显著上调。此外,我们检测了能反应病变鼻窦低氧状态的HIF-1α的表达水平。从Controls-Eos CRSwNP-non-Eos CRSwNP-CRSsNP, HIF-la的mRNA水平和蛋白表达呈现递增趋势,但只有在Controls和non-Eos CRSwNP之间、EosCRSwNP和CRSsNP之间呈现显著性差异。HIF-1α主要表达于间质中炎性细胞的胞核,少数表达于上皮细胞的胞核。②分析炎症指标和重塑介质之间的相关性,我们发现,中性粒细胞数与这些前纤维化因子呈正相关,而ECP的mRNA水平与其呈负相关。相反,ECP的mRNA水平与水肿严重程度呈正相关而中性粒细胞数与其呈反相关。此外,还发现中性粒细胞的数量与IL-8和HIF-1α的表达水平呈正相关,而ECP的mRNA水平与其呈反相关。TGF-β2阳性的细胞数与肌成纤维细胞数(r=0.715,P<0.05)和纤维蛋白原的表达水平(r=0.696,P<0.05)呈正相关。此外,HB-EGF与TGF-β2的表达之间呈正相关(r=0.702,P=0.03)。HIF-1α mRNA水平与IL-8(r=0.517,P<0.05)和TGF-β2(r=0.629,P<0.05)mRNA水平呈正相关。③为了更进一步验证中性粒细胞和TGF-β2及HIF-1α之间的关系,我们利用免疫组化连续切片观察中性粒细胞和TGF-β2之间,以及中性粒细胞和HIF-1α之间的染色定位及相关性。有趣的是,我们发现在controls组中,TGF-β2阳性的中性粒细胞占TGF-β2阳性细胞数的26%；在Eos CRSwNP中占40%；在non-Eos CRSwNP中占60%；在CRSsNP中占77%。TGF-β2阳性的中性粒细胞比例在各种CRS中显著高于controls组(P<0.05),而在non-Eos CRSwNP和CRSsNP中显著高于Eos CRSwNP。TGF-β2阳性的中性粒细胞占所有中性粒细胞的比例在controls组为79%,Eos CRSwNP组为75%,non-Eos CRSwNP组为80%,CRSsNP组为85%,这几组中的比例无显著性差异。对于HIF-1α,我们发现在controls组中HIF-1α阳性的中性粒细胞数占HIF-1α总阳性细胞的20%,在Eos CRSwNP中占26%,non-Eos CRSwNP中37%,在CRSsNP中占43%；这一比例在non-Eos CRSwNP和CRSsNP中显著高于controls组和EosCRSwNP组(P<0.05)。另外,在controls组中HIF-1α阳性的中性粒细胞数占总的中性粒细胞数的78%,在Eos CRSwNP中占81%,在non-Eos CRSwNP中占85%,在CRSsNP中占87%；这几组中的阳性比例无显著性差异。non-Eos CRSwNP和CRSsNP中的TGF-β2和HIF-1α阳性的中性粒细胞数显著高于controls组和Eos CRSwNP(P<0.05)。[结论]不同类型的CRS具有不同的组织重塑形式,特别是对于Eos CRSwNP和non-Eos CRSwNP来说体现的尤为明显。组织重塑与CRS的炎症类型具有相关性。