论文部分内容阅读
随着虾仁加工业的迅速发展,在生产虾仁的过程中,产生了大量的副产物。这些废弃物中含有丰富的蛋白质等资源,然而这些资源并没有得到很好的利用而被直接丢弃,这在浪费资源的同时造成了环境污染。本实验以虾副产物为原料,采用酶水解法制备抗氧化肽,并对其进行分离纯化。主要研究成果如下:通过对抗氧化肽定量构效关系的研究,结合几种常用酶的酶切位点分析,本实验决定以南美白对虾副产物作为研究原料,采用α-胰凝乳蛋白酶与嗜热菌蛋白酶复合酶解制备抗氧化肽。对虾加工副产物进行预处理,制成虾副产物粉。以蛋白的水解度为评价标准,优化酶解时间。确定α-胰凝乳蛋白酶最佳水解时间为4h,此时水解度为16.43%;嗜热菌蛋白酶最佳水解时间6h,水解度为5.50%。以2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除能力和铁离子还原能力为筛选标准,对虾副产物的酶解液实现分离、纯化。第一步使用1000 Da和500 Da的透析袋依次对酶解液进行透析分离,得到小于500 Da和500-1000 Da两种不同分子量的组分,经测定小于500 Da组分的DPPH自由基清除能力为1.99±0.01μmol AAE/g,铁离子还原能力为9.46±0.37μmol AAE/g;500-1000 Da的组分表现出较强的抗氧化活性,上述两指标值分别为3.87±0.03μmol AAE/g和14.65±0.08μmol AAE/g。第二步采用Sephadex G-15凝胶过滤层析对500-1000 Da的组分进行分离,上述组分被分为3个峰(G1-G3),其中峰G1抗氧化活性最高,它的DPPH自由基清除能力为7.96±0.06μmol AAE/g,铁离子还原能力为53.11±0.21μmol AAE/g;G2次之,其DPPH自由基清除能力为3.11±0.03μmol AAE/g,FRAP为8.98±0.21μmol AAE/g;G3最弱。第三步DEAE Sephacel离子交换层析将组分G1分为4个峰(H1-H4),其中峰G1-H2展现出最强的抗氧化活性,DPPH自由基清除能力为10.54±0.03μmol AAE/g,FRAP为89.29±0.01μmol AAE/g;G1-H1也显示出一定的抗氧化活性,其DPPH自由基清除能力为8.22±0.01μmol AAE/g,FRAP为54.79±0.06μmol AAE/g;G1-H3次之;G1-H4最弱。第四步选择反相高效液相色谱(RP-HPLC)对峰G1-H2进行分离,得到2个峰(F1-F2),经测定发现组分G1-H2-F1的抗氧化活性最高。收集得到的较纯的抗氧化活性肽组分G1-H2-F1测定其抗氧化活性,其每克蛋白DPPH自由基清除能力按抗坏血酸当量计(AAE)为14.91±0.09μmol AAE/g,铁离子清除能力为112.53±0.54μmol AAE/g。组分G1-H2-F1通过质谱分析测序得到得到三个肽:十肽GCKVALIVVG、十三肽DISHNQRGAILVR、十五肽YSLKMGGVSVVVIA,其中占主要成分的是结构为GCKVALIVVG的十肽。将所得三种不同的肽进行人工合成,测定各肽的抗氧化活性,结果显示十肽GCKVALIVVG的抗氧化活性较高,其DPPH自由基清除率为16.10±0.02μmol AAE/g,铁离子清除能力为245.37±0.03μmol AAE/g。这说明经过α-胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的复合酶解,能制备得到抗氧化活性高的肽。