【摘 要】
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红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)在世界范围内被广泛引进和养殖,受到病毒和细菌等病原体的严重影响。小分子热休克蛋白(s HSPs)已被证明对动物的免疫反应有积极的影响,但关于它们在红螯螯虾抵御细菌胁迫中的功能仍有待进一步阐明。因此,本研究进行了红螯螯虾鳃组织二代转录组测序,并对转录组发现的显著表达差异的红螯螯虾三个s Hsps基因(Cqs Hsps,命名为CqHsp24.06
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红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)在世界范围内被广泛引进和养殖,受到病毒和细菌等病原体的严重影响。小分子热休克蛋白(s HSPs)已被证明对动物的免疫反应有积极的影响,但关于它们在红螯螯虾抵御细菌胁迫中的功能仍有待进一步阐明。因此,本研究进行了红螯螯虾鳃组织二代转录组测序,并对转录组发现的显著表达差异的红螯螯虾三个s Hsps基因(Cqs Hsps,命名为CqHsp24.06、CqHsp41.97和CqHsp40.17)进行了克隆、信息学分析和表达变化规律研究。主要研究结果如下:(1)构建了红螯螯虾鳃组织的二代转录本数据库。从六个实验样品共读取了133322601个片段,检测到了39776631602个碱基,GC含量为37.41%~40.79%。与已有的数据库比对后一共注释了51298个转录本。差异表达转录本分析显示,相对于对照组,胁迫死亡组有1917个转录本表达有差异。相对于对照组,胁迫存活组共有3872个差异表达转录本。相对于胁迫存活组来说,胁迫死亡组共有1184个差异表达转录本。(2)对差异表达转录本进行GO富集分析,胁迫存活组与胁迫死亡组之间的转录本功能差异表达富集和对照组对胁迫组的转录本差异表达功能富集在生物学进程和细胞组分方面不同,在分子功能方面相同,均在抗氧化作用和电子载体活性功能上体现表达差异。通过KEGG数据库对这些差异表达转录本进一步的做功能富集分析发现,胁迫组相对于对照组的差异表达转录本更多的体现在代谢相关功能通路上,其中相关性最大是碳代谢通路和赖氨酸降解通路以及氧化磷酸化通路;胁迫存活组与胁迫死亡组之间的转录本功能差异表达也是富集在代谢相关通路上比较多,其中相关性最大的是碳代谢通路和氧化磷酸化通路。对同一功能通路的转录本差异表达富集分析发现,在碳代谢通路,氧化磷酸化通路,溶酶体通路,吞噬体通路上的差异表达转录本富集较多。(3)CqHsp24.06、CqHsp41.97和CqHsp40.17基因的编码序列长度分别为654、1128和1074 bp,分子量分别为24.06、41.97和40.17 k Da。它们与其他甲壳类动物的Hsp21序列基本一致,并具有一定的相似基序和结构域。CqHsp24.06包含alpha-crystin-hsps_p23样超家族结构域,CqHsp41.97和CqHsp40.17包含metazoan_ACD结构域。CqHsp 24.06、CqHsp41.97和CqHsp 40.17氨基酸序列均含有多个蛋白酶位点。三个红螯螯虾的小分子热休克蛋白的CqHsp 21标志性位点均为5、6、3和1,与日本大眼蟹(Macrophthalmus japonicus)、南美白对虾(Penaeus vannamei)和日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的HSP21位点相似。CqHsp41.97和CqHsp40.17与日本沼虾有相同的motif 8。而CqHsp 24.06没有motif 8,这与日本大眼蟹和南美白对虾的Hsp21 motif相似。(4)在正常组织中,CqHsp24.06在肠道中表达量最高,CqHsp41.97在鳃中表达量最高,CqHsp40.17在神经中的表达量最高。受到细菌胁迫后,CqHsp24.06、CqHsp41.97和CqHsp40.17在红螯螯虾鳃中的相对表达量呈先升高后降低的趋势。在嗜水气单胞菌胁迫下,CqHsp24.06和CqHsp41.97在3小时和12小时表达量最高。结果表明,Cqs Hsps参与了红螯螯虾的免疫反应,且对溶藻弧菌的敏感性高于嗜水气单胞菌。总之,本研究完成了红螯螯虾转录组测序,丰富和补充了红螯螯虾转录本信息。通过差异表达转录本的功能注释和富集分析发现碳代谢通路,氧化磷酸化通路,溶酶体通路,吞噬体通路参与了红螯螯虾的免疫应答。还克隆了与四个通路相关红螯螯虾3个不同的s HSP基因:CqHsp24.06、CqHsp41.97和CqHsp40.17。通过荧光定量PCR分析了它们在不同组织和在受不同细菌侵染后的表达变化情况。本研究只是对克隆的s HSP进行了生物信息学分析,初步的研究了红螯螯虾s HSPs基因的相对表达情况,而s HSP蛋白在红螯螯虾体内的作用机制和在免疫应答里的作用需要进一步的阐明。
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