由于矮化密植具有早果、丰产等优点,已成为国内外果树,特别是苹果生产的发展趋势。目前,在苹果生产中,树体矮化主要是通过选育矮密品种和采用矮化砧木来达到致矮目的,其中矮化砧是最理想的办法。苹果半矮化中间砧GM256具有矮化、抗寒、抗旱、抗盐碱等优良特征,由于生根困难,只能用于做矮化中间砧,丢掉了抗旱、抗盐碱等优良性状。转基因技术为苹果矮化砧的遗传改良开辟了一条新途径。利用转基因技术将rolB基因导入苹果矮化砧GM256中,极有希望获得矮化、抗寒、抗旱、抗盐碱、扦插易生根,适于矮化密植的砧木新品种。 由于苹果离体再生困难,极大限制了苹果的转基因改良。本试验从苹果矮化砧木品种M9和GM256组织培养体系的研究着手,优化苹果矮化砧的遗传转化体系,力争建立GM256和M9的遗传转化体系。主要取得以下研究结果: 1.稳定、高效的腋芽增殖体系研究 由建立无菌体系开始,对影响初代培养的因素进行了优化。结果表明,在新梢还未抽生前,最佳的接芽状态是待侧芽已露出4～5片小叶时接种;新梢快速生长期(4-5月)是最佳的取材时期;采用综合防治的方法即在初代培养基中附加0.1%的活性炭,同时结合连续转移外植体,黑暗培养,有效防止了木本植物组织培养当中普遍存在的褐化现象。 同时发现,GM256生长点伸长生长困难,而M9在BN2(MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L)培养基中可形成带有明显茎节的植株。以M9带单芽或双芽的茎段为外植体,通过正交试验筛选出适宜的腋芽分化培养基FH8(MS+BA5.0mg/L+NAA0.02mg/L)。将带腋芽茎段先在分化培养基中培养7天,然后将其转入无激素培养基中促进芽的生长,腋芽分化率可达到98%,增殖倍数为5.1。较大的芽被切离母体单独培养,将茎段剩余部分作继代培养,继代3次后仍有芽不断分化,增殖倍数又可提高,是一种较优的增殖途径。 2.不同因素对苹果离体叶片再生的影响 (1) 激素对再生的影响:细胞分裂素是影响叶片再生频率的重要因子。通过设计细胞分裂素和生长素组成不同的激素组合,研究了激素对叶片组织再生的影响。使用细胞分裂素BA与生长素NAA组合时,叶片可膨大,随BA浓度提高,叶片产生愈伤组织的量增加;使用KT与NAA组合时,叶片只是膨大,变脆,无愈伤组织的生成。而将M9叶片培养在BK3(MS+BA1.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.8mg/L+IBA0.5mg/L)分化培养基中,获得16.7%的再生频率。细胞分裂素TDZ对诱导苹果离体叶片再生最有效。M9叶片在适宜的分化培养基MT3(MS+TDZ3.0mg/L+NAA0.5mg/L)中获得37.6%的再生频率,而GM256叶片未再生,这也许与它的基因型有关。在此培养基中再生出的不定芽不易伸长生长,且