子宫平滑肌肉瘤(uterine leiomyosarcoma,ULMS)是子宫肉瘤中最常见的类型,发病率占子宫恶性肿瘤的1-2%。虽然ULMS的发病率低,但是其恶性程度居妇科恶性肿瘤之首,5年生存率仅为15-25%。因为其高度的侵袭性及对化疗药物的普遍抵抗性,即使是FIGO分期Ⅰ期和Ⅱ期的早期患者,复发率也高达53-71%,并且总生存率也低于40%。ULMS治疗效果差仍是目前全球面临的难题,究其原因主要在于其发生发展机制尚不明确及其对化疗药物的低反应率。多年来对ULMS的研究多集中于临床病理方面,分子生物学等基础研究较为局限。比较基因组学研究发现ULMS中存在明显的染色体数目及结构变异,属于基因不稳定肿瘤。但是具体引起ULMS的基因不稳定的原因尚不明确,需要深入探究。母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK),作为细胞内信号传导的重要调节性物质,能够影响细胞周期、细胞增殖、凋亡、剪接体组装、基因表达、胚胎发育、造血和肿瘤发生等多种细胞和生物学过程。在乳腺癌、结直肠癌等研究中,MELK都被证明是一个很强的致癌基因,参与细胞增殖、浸润、迁移、细胞分化等多个重要生理过程,也与细胞的有丝分裂密切相关。MELK作为一种激酶,其对相互作用分子的磷酸化调控是其对细胞生物学调控的一项重要机制。作为肿瘤研究中的明星分子,MELK在ULMS中异常高表达的原因及参与调控的分子机制尚不明确。在ULMS中,MELK与哪些分子相互作用,又是通过哪些下游分子通路参与到肿瘤的发生发展及化疗耐药的问题还有待于深入探究。因此,阐明MELK在ULMS中参与的分子机制对于该病的诊断、治疗及预后将起到至关重要的作用。本课题具体研究包括以下三个部分:1.子宫平滑肌肉瘤全基因组学及表达谱特征2.MELK通过磷酸化MAD2及RB1促进子宫平滑肌肉瘤的发生发展及染色体不稳定3.MELK通过miR34a/JAK2/STAT3通路促进子宫平滑肌肉瘤对阿霉素的化疗耐药第一部分子宫平滑肌肉瘤全基因组学及表达谱特征研究目的ULMS是子宫肉瘤中最常见的类型。虽然ULMS的发病率低,但是其恶性程度居妇科恶性肿瘤之首。研究证明ULMS属于基因不稳定肿瘤。基因组不稳定性是肿瘤的最重要特征之一,是肿瘤发生的早期事件,而肿瘤发生则是基因组不稳定性的延续。基因组不稳定性主要有两种类型:核苷酸不稳定性与染色体不稳定性(Chromosomal instability,CIN),两者发生的机制不同,但又相互交叉。如何从基因组层面全面解析ULMS的“基因组不稳定”特征,是明确ULMS“基因组不稳定”的关键。本部分旨在通过全基因组测序、目标区域捕获测序及全基因组表达谱芯片等方法全面解析ULMS基因组学的特征,并分析ULMS异常表达的基因,为探究ULMS的发生发展提供坚实基础。研究内容及方法1.将15对ULMS及正常对照的新鲜组织进行全基因组测序(Whole Genomic Sequencing,WGS)。将52例ULMS石蜡包埋组织进行目标区域捕获测序(Target Region Sequencing,TRS)。2.将8例冰冻ULMS组织和配对的对照组织(6例良性子宫平滑肌瘤和6例正常子宫肌层)进行全基因组表达谱芯片(Illumina Human HT-12v4 Expression BeadChip)分析,分析差异表达基因。3.将包含有27例ULMS组织芯片(Tissue microarray,TMA)进行UBE2C、TOP2A、PRC1、AURKA、CDC20及BUB1等分子的免疫组织化学染色来评价相关蛋白表达。研究结果1.全基因组测序及目标区域捕获测序结果显示,ULMS的基因不稳定性主要表现在染色体不稳定上。首先,在体细胞拷贝数改变(SCNAs)方面,染色体1q、8q和17q的拷贝数扩增,10q、13q、16q、17p存在不同程度的拷贝数下降。14例ULMS呈现倍型异常,其中8例倍型扩增显著,6例倍型缺失显著。其次,ULMS外显子区域体细胞基因突变频率仅为1.4±0.09/Mb,显著低于卵巢癌、子宫内膜浆液性癌、肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌等。P53突变仅见于 27.6%(8/29)的 ULMS 中,BRCA1/2、ATM、MUTYH 等与 DNA 修复相关的基因罕有突变(<5%)。2.表达谱芯片分析结果显示,ULMS的mRNA表达谱与子宫肌瘤和正常子宫肌层有显著差异。GO通路富集分析显示差异显著的基因富集于有丝分裂各个相关通路(mitotic cell cycle)(P=2.39E-64)。其中,MELK、UBE2C、TOP2A、PRC1、AURKA、CDC20、BUB1及PTTG3P等多个有丝分裂相关蛋白表达显著升高,其中MELK表达差异最显著(Fold Change=13.60437,P=5.56E-9)。3.免疫组化结果显示,相对于子宫平滑肌瘤和正常子宫肌层,MELK、UBE2C、TOP2A、PRC1、AURKA及CDC20等有丝分裂相关蛋白在ULMS中的表达显著升高,MELK阳性率为81.35%。研究结论1.ULMS基因组特征主要为染色体不稳定而非核苷酸不稳定,P53等DNA修复相关基因突变并非ULMS基因组不稳定的发生机制。2.ULMS中有丝分裂相关蛋白表达显著升高,有丝分裂异常可能为造成ULMS染色体不稳定的关键因素。MELK为表达差异最显著基因。第二部分MELK通过磷酸化MAD2及RB1促进子宫平滑肌肉瘤的发生发展及染色体不稳定研究目的导致ULMS预后差的主要原因在于该病发生发展机制不明。前期研究证明ULMS为染色体不稳定肿瘤。细胞有丝分裂异常是导致染色体不稳定的重要因素,但造成ULMS染色体不稳定的原因尚不明确。在乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中,MELK都被研究证明是一个功能很强大的致癌基因,其参与作用渗透于恶性肿瘤的细胞增殖、浸润、迁移、细胞分化等多个重要过程,也与细胞的有丝分裂密切相关。MELK的磷酸化作用是其参与细胞分子通路的重要调节机制。本课题分析ULMS与正常子宫肌层和良性子宫肌瘤的表达谱芯片发现MELK在ULMS中异常高表达,本部分意在通过体内体外实验探究MELK对ULMS生物学功能的影响,并深入探究MELK促进ULMS的发生发展及染色体不稳定的的作用机制。研究内容及方法1.将ULMS的组织芯片进行MELK免疫组化染色,分析表达差异及与预后的相关性。构建MELK过表达及干扰的慢病毒载体,并建立了 MELK过表达及干扰的ULMS细胞系。通过EdU细胞增殖检测实验、MTT细胞增殖实验、平板克隆实验、流式检测细胞周期实验、Transwell侵袭迁移实验等实验探究MELK对ULMS细胞系转移、增殖及周期等的影响。同时,利用western blot等实验探究MELK对ULMS上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、细胞周期以及重要分子通路相关分子的影响。2.使用免疫共定位、免疫共沉淀、免疫组化相关性分析等方法,探究与MELK相互作用并磷酸化的靶分子,明确靶分子参与的分子通路及对ULMS发生发展的影响,探究MELK与ULMS发生发展之间的密切联系。3.建立MELK过表达的正常子宫肌层细胞系及良性子宫肌瘤细胞系,通过MTT细胞增殖实验、Transwell侵袭迁移实验等探究MELK对正常细胞系的肿瘤生物学功能的影响。同时,进行动物皮下成瘤以及肾包膜下成瘤实验,观察细胞核分裂象及异型性变化,进而明确MELK是ULMS发生发展的早期关键分子。研究结果1.MELK在ULMS中高表达,并且和ULMS的不良预后相关。MELK的免疫组化分析及GEO数据库分析显示,相比于正常子宫肌层和子宫肌瘤,MELK在ULMS中异常高表达(ULMS中阳性率81.35%),并且,GEO数据库分析还揭示了 MELK在预后差的ULMS中表达更高。免疫组化的生存曲线显示MELK与ULMS的不良预后相关,MELK表达量越高的患者预后越差(P=0.0298)。2.MELK可以促进ULMS的细胞增殖和周期、侵袭迁移等,并且影响细胞周期蛋白和EMT相关蛋白的表达。构建MELK过表达及干扰的细胞系后,通过体外的功能试验,证明MELK过表达能够促进ULMS细胞系的细胞周期及增殖能力、克隆形成能力、侵袭迁移能力等,MELK干扰表达之后这些能力随之减弱。同时,Western blot的结果显示,MELK过表达后,细胞增殖相关蛋白CCND1、CCNE1、CKD4、CDK6等的表达量也随之增加,p21、p27等的表达量降低,EMT相关蛋白中,N-cadherin、Slug、Snail、Vimentin的表达也随之增高,E-cadherin的表达会降低,反之亦然。通过体内皮下成瘤实验及口饲药物实验,证明MELK可以显著提高ULMS的增殖能力,MELK抑制剂OTSSP167能够明显抑制ULMS的生长。3.MELK通过磷酸化MAD2和RB1,导致ULMS细胞染色体不稳定。通过免疫共沉淀的方法,证明MAD2和RB1可以和MELK直接结合。并且,过表达MELK后,MAD2和RB1的磷酸化水平均显著增高。RB1磷酸化后,E2F表达水平增高,细胞周期相关蛋白表达也随之增高,促进细胞周期。通过免疫荧光共定位的方法证明MAD2和MELK在细胞内共同定位于细胞核周围。通过免疫荧光及流式细胞学等方法证明MELK可以显著提高处于有丝分裂M期的细胞比例。通过免疫共沉淀等方法,证明MELK将MAD2磷酸化后,从有活性的C-MAD2形式转化为无活性的O-MAD2,MAD2与CDC20结合能力下降,导致CDC20与有丝分裂检查点复合物解离,激活APC/C,诱导细胞提早进入后期。显微镜观测到MELK过表达后出现染色体不均等分离,有丝分裂出现异常。4.MELK可以促进正常子宫肌层细胞和良性子宫肌瘤细胞向恶性转化。体外功能实验证明MELK能够促进正常子宫肌层细胞系和良性子宫肌瘤细胞系的细胞增殖和侵袭迁移能力。同时,动物皮下成瘤实验和动物肾包膜下成瘤实验证明,MELK过表达后,子宫肌层细胞系和子宫肌瘤细胞系的成瘤能力明显增强,并且MELK过表达后子宫肌层细胞系和子宫肌瘤细胞系的核异型性及核分裂象也显著增加。同时,MELK在不典型子宫平滑肌瘤免疫组化结果发现Ⅱ型ALM阳性率明显高于Ⅰ型(Ⅰ型、Ⅱ型阳性率分别为23.08%和51.72%,P<0.01)。Ⅱ型ALM可能为ULMS的癌前病变,MELK可能为驱动Ⅱ型ALM向ULMS恶性演进的关键分子。研究结论1.MELK在ULMS中高表达,并且与不良预后相关。2.MELK可以促进ULMS细胞的增殖周期、侵袭迁移等肿瘤生物学功能。3.MELK通过磷酸化MAD2和RB1,导致有丝分裂出现姐妹染色单体不均等分离,引起染色体不稳定发生。4.MELK可能为促进ULMS早期发生发展的关键分子。研究目的ULMS对化疗药物反应率低是其预后差的另一重要原因。目前美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)推荐的 ULMS化疗方案为单用阿霉素或者吉西他滨联用多西他赛。在一项阿霉素Ⅲ期临床试验中,ULMS的客观反应率(Objective response rate,ORR)为25%,联合用药方案治疗ULMS的ORR不足25%。目前的治疗方案中客观缓解率都比较低,两项有关PD1抑制剂的Ⅱ期临床试验显示ULMS患者均对治疗无反应。因此,本部分旨在深入探究MELK参与ULMS化疗耐药的作用机制,为ULMS的治疗提供新的靶点和思路。研究内容及方法1.构建MELK过表达及干扰的ULMS细胞系,通过阿霉素细胞毒性实验、耐药克隆平板实验、耐药细胞增殖实验以及流式凋亡实验等探究MELK对ULMS阿霉素化疗耐药的影响。通过动物体内皮下成瘤实验及口饲药物实验探究MELK抑制剂对ULMS化疗效果的影响。2.通过mRNA测序和miRNA测序,比较MELK过表达和对照的ULMS细胞系阿霉素作用前后的mRNA和miRNA表达差异,分析差异表达的分子及相关通路。通过Western blot实验、qRT-PCR实验等探究MELK参与ULMS阿霉素化疗耐药的作用机制。3.探究MELK对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响及其参与的分子通路。使用荧光标记miRNA转染实验、外泌体RT-qPCR等实验探究MELK与下游分子miR-34a参与调控巨噬细胞极化的途径,luciferase双荧光素酶报告基因实验探究miR-34a的靶基因。使用ELISA实验检测M2型和M0型肿瘤相关巨噬细胞所分泌的IL6的差异,并且通过阿霉素细胞毒性实验探究IL6对ULMS阿霉素化疗耐药的影响。研究结果1.MELK可以在体内外可以增强ULMS细胞对阿霉素的化疗耐药能力。细胞毒性实验发现MELK过表达的ULMS细胞系半数致死量(IC50)明显高于对照细胞,在相同浓度阿霉素作用下MELK过表达的细胞存活率更高。当干扰掉MELK的表达后,结果趋势相反。耐药细胞增殖实验显示,MELK过表达的细胞系增殖能力相比于对照组明显增强。耐药平板克隆实验显示相同浓度阿霉素作用下,MELK过表达细胞克隆能力更强,MELK干扰后克隆能力减弱。凋亡实验结果显示,过表达MELK明显抑制了细胞的凋亡,MELK表达敲低后细胞凋亡显著增强。进一步研究显示MELK的表达存在药物依赖性,即随着阿霉素浓度的增加,MELK的表达量也随之增加。在体内实验中,我们发现阿霉素与MELK抑制剂OTSSP167联用的肿瘤大小和重量明显小于单用阿霉素的肿瘤(两药联用与单用阿霉素组重量分别为:0.1618±0.01732g、0.2900±0.02153g,P<0.01)。2.mRNA测序显示差异表达基因集中于白介素相关通路,miRNA测序显示miRNA-34a表达差异显著。mRNA测序显示,差异表达基因集中于白介素信号通路(Signalingby Interleukins,P=7.15E-5)、白介素 4、13 相关通路(Interleukin-4 and 13 signaling,P=3.1E-6)、细胞因子相关通路(Cytokine-cytokine receptor interaction,P=3.9E-4)等。IL6均参与以上通路,并且表达差异显著(P=8.76E-6)。miRNA测序显示,miRNA-34a在MELK过表达及阿霉素处理的细胞中的表达均显著降低。3.MELK激活JAK2/STAT3通路,激活BCL2,抑制凋亡。MELK干扰后,Western blot结果显示磷酸化的JAK2、STAT3均下调,P53表达上调,MELK过表达后,磷酸化JAK2和磷酸化STAT3水平上调,P53表达下调。同时,MELK过表达后BCL2的表达上调,MELK干扰后BCL2的表达随之降低。该结果与细胞凋亡趋势相符。4.MELK抑制miRNA-34a,通过外泌体途径作用于肿瘤相关巨噬细胞,解除对IL6R的抑制,从而激活JAK2/STAT3通路,使其极化为M2型。ULMS细胞系MELK过表达后,miRNA-34a表达下降,MELK干扰后,miRNA-34a表达随之增加。并且,荧光的miRNA-34a转染实验结果显示加入MELK干扰细胞条件培养基的巨噬细胞中miRNA-34a表达明显增加。进一步实验结果发现MELK干扰的ULMS细胞系的外泌体中miRNA-34a表达更高。miRNA-34a干扰表达后,巨噬细胞中CD206(M2型巨噬细胞标志分子)表达升高。Luciferase双荧光素酶报告基因实验证实IL6R是miR-34a的靶基因。在巨噬细胞中加入MELK过表达及干扰的ULMS细胞系的条件培养基,结果发现,加入MELK过表达ULMS细胞条件培养基的巨噬细胞IL6R、磷酸化JAK2、磷酸化STAT3表达水平均升高,并且M2型巨噬细胞标志性分子Argl、CD206表达升高,M1型标志性分子INOS表达降低。加入MELK干扰ULMS细胞条件培养基的巨噬细胞的相应分子表现出相反的趋势。5.M2型巨噬细胞可以分泌IL6,促进子宫平滑肌肉瘤细胞对阿霉素的耐药。ELISA显示,M2型巨噬细胞分泌出的IL6相比于MO型明显增多,并且加入MELK过表达ULMS细胞条件培养基的巨噬细胞分泌的IL6也明显增加。阿霉素细胞毒性实验证实,在培养基中加入IL6的ULMS细胞在相同浓度阿霉素作用下存活率更高,其半数致死量(IC50)也显著升高。并且用M2型巨噬细胞的条件培养基培养ULMS细胞的IC50也明显著升高。研究结论1.MELK通过激活JAK2/STAT3通路,激活BCL2,抑制细胞凋亡,促进ULMS对阿霉素的化疗耐药。2.MELK还可以通过JAK2/STAT3/miRNA-34a环形反馈通路,通过外泌体途径作用于巨噬细胞,促进其向M2型极化,分泌IL6,也促进了 ULMS对阿霉素的化疗耐药。研究结论1.ULMS为基因不稳定肿瘤,其不稳定性主要表现为染色体不稳定。2.MELK通过磷酸化MAD2和RB1导致有丝分裂异常,出现姐妹染色体发生不均等分离,造成染色体不稳定,促进ULMS的发生发展。3.MELK通过激活JAK2/STAT3/miR-34a/IL6R环形反馈通路抑制细胞凋亡,促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化,促进ULMS对阿霉素的化疗耐药。本研究创新点1.ULMS的新鲜组织进行全基因组测序,揭示ULMS的基因不稳定性表现为染色体不稳定。2.ULMS组织进行全基因组表达谱分析,揭示了 ULMS中有丝分裂相关蛋白表达显著升高,有丝分裂异常可能为造成其染色体不稳定的关键因素。3.首次证实了 MELK通过磷酸化MAD2导致细胞有丝分裂检查点功能失活,致使姐妹染色体发生不均等分离,出现异常有丝分裂,导致染色体的不稳定。促进ULMS的发生发展。为ULMS的治疗提供新的思路。4.首次证实了 MELK通过激活JAK2/STAT3/miR-34a/IL6R这一环形反馈通路抑制细胞的凋亡,并且促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化,导致ULMS对阿霉素的化疗耐药。为ULMS的化疗耐药提供新的增敏靶点。本研究的局限性及不足1.本研究为临床前的基础研究,要实现临床应用转化尚需要经过多个研究阶段。2.MELK的作用机制众多,与其相互作用的分子渗透到细胞代谢的多个过程,本研究仅涉及到小部分参与的通路,未对其他可能参与的分子通路进行探究。3.本研究未引入人源肿瘤异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX),如果可以建立若干病人的PDX模型,可以进一步证明研究结果,提高研究的可靠性。