研究背景及目的：鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是最常见的头颈部肿瘤之一,好发于中国南部及东南亚地区。鼻咽癌起源于鼻咽上皮细胞,其发病以明显的区域分布特点、遗传易感性、与EB病毒密切相关等为特征。目前,鼻咽癌患者的治疗主要是采用放疗及放化疗为主的综合治疗模式,许多早期患者经治疗可获得痊愈。但是,仍然有约30%-40%的患者由于转移和复发,未能获得长期生存。因此,研究鼻咽癌复发和转移的分子机制,寻找治疗新靶点,提高鼻咽癌的放疗疗效,是目前我们面临的艰巨任务。分子靶向药物与放疗联合可能是提高鼻咽癌治疗效率的新策略。目前研究较多的常用于鼻咽癌的分子靶向药物主要是抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗和抗VEGF抗体贝伐单抗,而关于其他分子靶向药的研究较少。我们知道,磷酸化3-激酶(PI3K)/Akt/雷帕霉素蛋白(mTOR)通路是细胞内的信号转导通路,它在肿瘤的形成中起着至关重要的作用,该通路的蛋白参与了细胞存活、增殖、转移、细胞周期进展、凋亡过程。PI3K/Akt/mTOR通路调节鼻咽癌增殖的机制可能包括PI3K、PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome10,第10号染色体磷酸酶和张力蛋白同源丢失性基因)、Ras癌基因和EGFR(epidermal growth factor, EGFR)突变。之前有研究报道PI3K/Akt/mTOR信号通路在肺癌、胃癌、肾癌和卵巢癌等多种肿瘤中活化,抑制这条通路可以通过诱导肿瘤细胞死亡来增强辐射敏感性。鼻咽癌的细胞株和组织中也表达磷酸化的Akt (p-Akt),并且我们既往研究发现鼻咽癌细胞株和鼻咽癌患者的组织中都存在Akt的表达,在鼻咽癌患者的组织切片中我们也检测到辐射可以导致Akt表达增高,此外,我们还发现Akt的表达水平与转移密切相关,这表明PI3K/Akt/mTOR通路可能是鼻咽癌治疗的新靶点。有研究报道通过双向PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235靶向PI3K/mTOR通路,可以在鼻咽癌中增强化疗药物(顺铂)的抗肿瘤作用。但是,目前国内外尚无双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌辐射敏感性影响的研究。GSK2126458是一种高效的可口服的p110α, p110β,p110γ,p110δ,mTORC1和]mTORC2的抑制剂,在乳腺癌中它可以导致p-Akt (S473)水平下降,抑制肿瘤的生长及诱导G1期细胞阻滞。目前,关于GSK2126458在实体肿瘤中的作用的研究正在Ⅰ期临床试验中(NCT00972686). PKI-587是一种高效的双向PI3Kα, PI3Kγ和mTOR的抑制剂,其在包括乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、肠癌及肝癌在内的多种肿瘤细胞株中都有强烈的抑制生长作用。由于在体外及移植瘤模型中PKI-587都发挥了强效的抗肿瘤作用,因此,为了更好的评估它的抗肿瘤活性,更多的Ⅰ期临床试验(NCT00940498)正在开展中。在本研究中,我们在体内外水平来研究双向PI3K/mTOR抑制剂的抗肿瘤活性及对辐射敏感性的影响。为了更好的观察双向PI3K/mTOR抑制剂的效果及证实结果的可靠性,我们同时研究了两种双向PI3K/mTOR抑制剂：GSK2126458和PKI-587。我们认为联合双向PI3K/mTOR抑制剂和辐射可以增强鼻咽癌患者的临床疗效,并为今后鼻咽癌的靶向治疗的发展提供理论基础。方法：1.细胞增殖实验细胞增殖实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌增殖的影响。将对数生长期的鼻咽癌细胞以每孔2×103个/100ul接种于96孔板中,贴壁24小时后在每孔中加入不同浓度的GSK2126458或PKI-587或培养基,继续培养72小时。然后,加入50ul的MTT溶液,在37℃的孵箱中培育2小时,移去MTT液,加入100ul的DMSO,在酶标仪下分别检测550nm和630nm处的吸光度。生长分数是以对照组为基准来计算的。每个实验重复至少三次,每次至少3个复孔。2. Western blot实验Western blot实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的影响。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂的细胞裂解液来裂解鼻咽癌细胞,并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将约40ug的总蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,清洗4遍后,用5%小牛血白蛋白(BSA)在室温下封闭一小时后,加入一抗4℃孵育过夜。再清洗3遍后,加入特异性二抗,在室温下孵育1小时。最后用化学发光试剂盒检测蛋白条带。每个实验至少重复3次。3.划痕实验划痕实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移的影响。将细胞以80%-90%的密度种入6孔板中,贴壁24小时后,用0.2ml的枪头在汇合的单层细胞上轻轻滑过,用PBS洗干净划下的悬浮细胞后,加入含有双向PI3K/mTOR抑制剂的无血清培养基或单纯无血清培养基(对照组)培养24小时,并在不同的时间点(0h,12h,24h)拍照,测量划痕宽度。每组3个复孔,每孔随机选取9个含划痕的视野拍照测量,每个实验重复3次。4.细胞迁移和侵袭实验细胞迁移和侵袭实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对细胞迁移和侵袭的影响。我们采用transwell小室来检测细胞的迁移和侵袭。Transwell小室的顶部和底部通过含有胶原质的8um的滤过膜分开。在迁移实验中,直接将培养基中含有0.1%BSA的1×105个肿瘤细胞种入小室内,而侵袭实验则需要加铺20-50μg/cm2的BD公司的基质胶在小室内,再种细胞,将含有GSK2126548或PKI-587的培养基加入小室下方。在37℃的孵箱中孵育24小时后,用棉签擦去留在残留在小室内没有迁移或侵袭的细胞。迁移和侵袭到小室下方的细胞则用甲醇固定、结晶紫染色。在200倍显微镜下随机取5个视野计数迁移和侵袭的细胞,每个实验重复3次。5.克隆形成实验克隆形成实验检测双向PI3K/mTOR抑制剂对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响。4种鼻咽癌细胞株按照不同浓度种入60mm的小皿中。在照射不同剂量射线(0,2,4,6,8Gy)前1小时加入GSK2126548或PKI-587,药物维持24小时后更换培养基。培养约14天后,细胞用甲醇固定,并用0.5%的结晶紫染色。计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率及存活分数。每个实验进行3次,每次3个复孔。运用GraphPad Prism5.0软件进行多靶单击曲线拟合,并绘制存活曲线。采用的多靶单击模型的公式为：SF=1-(1-e-D/D0)N。6.免疫荧光实验免疫荧光实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对双链DNA损伤的影响。我们用γ-H2AX抗体来检测DNA双链的断裂损伤。首先,将一定浓度的细胞种在玻片上37℃孵育24小时,然后加入GSK2126548(0.003μM)或PKI-587(0.03μM)孵育1小时后,进行4Gy射线照射,照射后24小时计数细胞内焦点数目。照完射线后24小时先用4%的多聚甲醛固定细胞,再用抗γ-H2AX的一抗4℃孵育过夜,洗掉一抗后,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗。在荧光显微镜下观察DNA损伤。每组5个复孔,每孔至少计数50个细胞,每个实验重复3次。7.细胞周期实验和细胞凋亡实验细胞周期及凋亡实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂联合放疗对细胞周期和凋亡的影响。将对数生长期的细胞种入6孔板中,加入GSK2126548或PKI-5871小时后,接受4Gy射线照射,照射后24小时收集细胞,用含有2%胎牛血清的冰PBS洗涤2遍后,加入70%的冰乙醇中-20℃过夜,沉淀、冲洗细胞后,在室温下加入PI染色液染色30分钟。凋亡实验则参照BD公司的annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书进行。使用FACS流式细胞仪的CellQuest软件进行数据分析,所有的实验重复至少3次。8.动物实验动物实验用来检测双向PI3K/mTOR抑制剂对体内鼻咽癌增殖及辐射敏感性的影响。将5×106个鼻咽癌5-8F细胞制成单细胞悬液,皮下注射于5-7周雌性BALB/c裸鼠右腿外侧。当肿瘤体积达到200mm3时,将小鼠随机分入对照组和实验组(每组5只小鼠)。实验组接受300μg/kg GSK2126458,25mg/kg PKI-587,单纯辐射组,300μg/kg GSK2126458联合辐射或25mg/kg PKI-587联合辐射组。GSK2126458给药方法为：每周连续灌胃5天,1次／天。PKI-587给药方法为：尾静脉注射,1次/5天。辐射组采用直线加速器进行辐射,剂量率为5OOcGy/min,源皮距为100cm,小鼠每隔一天接受2Gy的照射,共4次。联合给药和辐射组则小鼠在给药后2小时接受辐射。每2天测量一次肿瘤大小。肿瘤大小计算公式为：肿瘤体积=(长×宽2)/2。接受处理后12天,当肿瘤体积达到3000mm3时,处死小鼠,取下肿瘤组织用来做Western bolt、免疫组化和TUNEL实验。9.免疫组化和TUNEL实验免疫组化和TUNEL实验用来分析双向PI3K/mTOR抑制剂联合辐射对肿瘤组织通路各蛋白变化的影响。免疫组化标本来源于5-8F小鼠移植瘤模型,组织切片厚度5mm。组织切片先在4%多聚甲醛中固定过夜,再用石蜡包埋。脱蜡和水化后,切片加入含有10mM柠檬酸钠缓冲液中,置于微波炉中20分钟,进行抗原修复。然后,组织切片用一抗4℃孵育过夜,再加入二抗室温下孵育1小时。最后用苏木素和染色,并在显微镜下观察及拍照。每张切片至少观察3个随机视野。TUNEL实验参照Promega公司的凋亡检测试剂盒说明书进行。10.统计学分析本实验中所有的数据均采用均数±标准差表示,每个实验至少重复3次。均数间比较采用双侧t检验(two-tailed unpaired student’s t-test)或完全随机设计资料的方差分析(one-way ANOVA)。在体内实验中,研究药物与辐射的协同抗肿瘤效应,采用析因分析。P<0.05被认为有统计学差异。结果：1.GSK2126548和PKI-587通过阻断PI3K/Akt/mTOR通路抑制鼻咽癌细胞的增殖Western blot实验结果显示,相对于正常永生化鼻咽上皮细胞NP69而言,4株鼻咽癌细胞中磷酸化mTOR, Akt,S6和4EBP1表达增加。MTT结果显示,GSK2126548和PKI-587在低浓度时就可抑制4株鼻咽癌细胞的增殖,其中5-8F和CNE-2细胞效果最显著。并且随着浓度增高,药物对细胞增殖的抑制作用更明显。Western blot实验证实GSK2126458和PKI-587可以抑制nTOR, Akt, S6和4EBP1的磷酸化,同时增强凋亡蛋白C-PARP的表达,并且这种效应呈时间和剂量依赖性。这进一步揭示了GSK2126548和PKI-587对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用,是通过阻断PI3K/Akt/mTOR通路实现的。2.GSK2126548和PKI-587抑制鼻咽癌细胞迁移及侵袭划痕实验和transwell迁移实验表明,GSK2126548和PKI-587显著的降低了划痕愈合率及迁移出transwell小孔的细胞数量。Transwell侵袭实验同样发现,GSK2126548和PKI-587可降低穿过基质胶的细胞数量,这表明双向PI3K/mTOR抑制剂GSK2126548和PKI-587可抑制鼻咽癌细胞的迁移及侵袭能力。Westernblot实验进一步证实GSK2126458和PKI-587主要通过影响EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin的表达来影响细胞的侵袭和迁移能力3.GSK2126548和PKI-587通过靶向PI3K/Akt/mTOR通路增强鼻咽癌细胞辐射敏感性克隆形成实验结果表明,与单纯辐射组相比,GSK2126458或PKI-587联合辐射,可降低克隆形成数目。并且相对于单纯辐射组而言,辐射联合药物在各组的SER10分别为：CNE-1:GSK21264581.31, PKI-5871.17:CNE-2: GSK21264581.56, PKI-5871.49；5-8F:GSK21264581.51, PKI-5871.46:6.10B:GSK21264581.42,PKI-5871-35.Western blot实验进一步显示,单纯辐射可增强Akt,mTOR,和S6的磷酸化水平,而联合辐射和双向PI3K/mTOR抑制剂则可抑制这一效应。4.GSK2126548和PKI-587对鼻咽癌细胞的辐射增敏作用可能与增加γ-H2AX的表达有关γ-H2AX是DNA双链断裂损伤的标志,我们通过免疫荧光法检测辐射后24小时鼻咽癌细胞γ-H2AX灶数目的变化来进一步研究GSK2126458和PKI-587增强辐射敏感性的机制。联合4Gy辐射和双向PI3K/mTOR抑制剂,较单纯4Gy辐射组相比,细胞内γ-H2AX灶数目显著增多.这表明GSK26548和PKI-587增强鼻咽癌辐射敏感性的机制可能与增强辐射后DNA双链断裂损伤有关。5.GSK2126548和PKI-587诱导鼻咽癌细胞周期阻滞及凋亡发生流式细胞学检测结果发现,单纯加入GSK2126458或PKI-587可引起G1期细胞比例增高,S期比例轻度下降,导致G1期阻滞。单纯辐射则可引起G2期阻滞,而联合辐射和双向PI3K/mTOR抑制剂可明显增强G2期阻滞效应,Western blot实验检测周期相关蛋白发现,辐射联合双向PI3K/mTOR抑制剂可以明显抑制细胞周期正向调节蛋白CyclinD1表达,同时增强周期阻滞相关蛋白P21和P27的表达,这表明辐射与双向PI3K/mTOR抑制剂联合可以通过影响细胞周期相关蛋白的表达来影响细胞周期的进程。同样,流式细胞学检测辐射后24小时细胞凋亡情况发现,两种双向PI3K/mTOR抑制剂GSK和PKI-587均可诱导鼻咽癌CNE-2和5-8F细胞凋亡比例增加,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(CNE-2:PGsK=0.002,PPKI=0.030；5-8F:PGsK:0.007, PPKI=0.030)；双向PI3K/mTOR抑制剂联合辐射后,细胞的凋亡比例进一步增加,与单纯辐射组比较,差异具有统计学意义(CNE-2:PGsK+RT<0.001,PPKI+RT<0.001；5-8F:PGSK+RT<0.001, PPKI+RT<0.001)。结果表明,双向PI3K/mTOR抑制剂联合辐射,可诱导鼻咽癌细胞周期阻滞及增加凋亡。6.GSK2126548和PKI-587在体内有显著的辐射增敏作用我们用5-8F移植瘤模型用来评估双向PI3K/mTOR抑制剂GSK2126548和PKI-587在体内对鼻咽癌敏感性的影响。结果显示,单纯加入GSK2126548或PKI-587对移植瘤生长的抑制作用不太明显,而单纯辐射却发挥了较明显的抑制肿瘤生长的作用,更重要的是,联合辐射和双向PI3K/mTOR抑制剂组的抗肿瘤作用最为明显。将收集的动物实验不同组别移植瘤体积的数据进行统计,经析因分析结果显示任何一种双向PI3K/mTOR抑制剂,GSK2126548(P<0.05)或PKI-587(P<0.05),与辐射联用都具有协同抗肿瘤作用。为了进一步证实双向PI3K/mTOR抑制剂对PI3K/Akt/mTOR通路的影响,我们通过免疫组化检测了移植瘤组织标本中磷酸化Akt, mTOR和4EBP1的表达情况,发现GSK2126458和PKI-587都可抑制植瘤组织标本中Akt,mTOR和4EBP1的磷酸化,并且与体外实验的结果一致,联合辐射和双向PI3K/mTOR抑制剂组磷酸化mTOR, Akt和4EBP1水平表达最低。进一步,对鼻咽癌移植瘤组织标本中增殖蛋白和凋亡蛋白的检测中,我们发现,联合组增殖蛋白(Ki-67)表达明显降低而凋亡水平却明显升高(TUNEL实验)。同样,移植瘤组织Westernblot结果也揭示加入双向PI3K/mTOR抑制剂组磷酸化Akt和4EBP1水平较对照组和单纯辐射组明显降低,而辐射联合药物组表达最低。该结果表明,在体内,双向PI3K/mTOR抑制剂对肿瘤生长的抑制作用不太明显,但双向PI3K/mTOR抑制剂GSK2126458或PKI-587与辐射联合时,却能明显增强对肿瘤的抑制作用。我们认为,双向PI3K/mTOR抑制剂与辐射协同抗肿瘤的作用可能与PI3K/Akt通路受到抑制及凋亡增加有关。结论：1.双向PI3K/mTOR抑制剂GSK2126458和PKI-587可阻断PI3K/Akt/mTOR通路,并抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力；2.GSK2126458和PKI-587通过抑制DNA断裂损伤的修复、诱导细胞G2/M期阻滞及诱导凋亡等机制,增强鼻咽癌细胞辐射敏感性；3.GSK2126458和PKI-587在体内与辐射联用具有协同抗肿瘤作用。