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目的:丙戊酸（Valproic acid,VPA）作为治疗癫痫的药物被广泛使用,其中脂肪性肝毒性为严重不良反应。研究显示长期应用VPA治疗患者可出现肉碱缺乏,VPA诱导的上述毒性反应可能与继发性肉碱缺乏有关。本课题组对99例单用VPA的癫痫患儿进行血清肉碱检测,其中18例（18.2%）出现了肉碱缺乏,但患儿肝功能指标均正常。有研究对299例单用VPA的癫痫患儿进行血清肉碱检测,有63例（21.1%）患儿患有肉碱缺乏症;54例无症状,无患儿出现肝毒性或肝功能异常。从以上研究可以看出,仅从肉碱缺乏的角度难以完全解释VPA导致的肝毒性,可能存在其他机制。研究表明,VPA可抑制β-氧化过程中的相关酶从而影响线粒体脂肪酸β-氧化,但具体途径尚不明确。酰基肉碱穿过线粒体和细胞膜进入血浆,血浆酰基肉碱谱可反映线粒体内酰基Co A的分布。当发生脂肪酸β-氧化途径受阻,可引起相应的酰基Co A的蓄积,导致血浆中相应的多种酰基肉碱发生改变。目前,血浆酰基肉碱谱分析用于新生儿线粒体脂肪酸氧化缺乏症（m FAODs）的筛选,是线粒体功能障碍的重要的生物标志物之一。多项研究发现,大多数线粒体代谢酶需要进行乙酰化修饰,而乙酰化对脂肪酸β-氧化极为重要。VPA可抑制组蛋白去乙酰化酶活性,从而可调控多种蛋白的乙酰化水平。因此VPA也可能通过调控包括脂肪酸β-氧化酶在内的多种蛋白的乙酰化,从而影响脂质代谢,造成肝脂肪变性。因此本课题从酰基肉碱谱出发,研究VPA对肉碱状态及脂肪酸β-氧化相关代谢途径的影响,探究VPA致肝毒性作用及相关机制。本研究采用靶向代谢组学分析技术,以VPA致肝功能异常患者为研究对象,利用多元统计学方法进行组间差异性分析,筛选差异性酰基肉碱作为VPA致肝功能异常潜在生物标志物;在动物和细胞水平上研究VPA调控酰基肉碱谱变化的相关机制,探究VPA影响线粒体脂肪酸β-氧化途径;利用定量乙酰化蛋白质组学技术探究VPA对人正常肝细胞系LO2细胞蛋白乙酰化水平的影响;利用基于激活线粒体脂肪酸β-氧化代谢途径,寻找潜在VPA致肝毒性保护剂。研究方法:1.检测VPA致肝功能异常患者酰基肉碱谱,筛选差异性酰基肉碱成分本研究共纳入健康对照儿童50例及服用VPA的癫痫患儿55例,其中根据肝功能指标（ALT＞2×ULN和/或AST＞2×ULN）将癫痫患儿分为肝功能正常组（NLF组,30例）和肝功能异常组（ALF组,25例）。采用HPLC-QTOF/MS技术对三组儿童的游离肉碱及35种酰基肉碱水平进行了检测。利用多元统计分析方法（PLSDA）进行统计分析,筛选差异酰基肉碱成分。2.VPA影响酰基肉碱代谢的相关机制研究在动物和细胞水平研究VPA致肝毒性条件下,采用RT-PCR、Western Blot等技术考察酰基肉碱代谢相关基因和蛋白表达量的变化,并分析其与特异性酰基肉碱成分的相关性。3.探究PPARα的激活对VPA致肝毒性的保护作用在VPA致小鼠和细胞肝毒性模型中,通过小鼠肝脏组织病理学鉴定、肝功能相关生化指标的测定,定量脂质组学对脂质成分含量和酰基肉碱谱的测定、氧化应激指标的测定、检测脂肪酸β-氧化相关基因表达水平等手段,探究由非诺贝特介导的PPARα的激活对VPA致肝毒性的保护作用。4.探究小檗碱对VPA致肝毒性的保护作用利用串联质谱标签（Tandem Mass Tags,TMT）技术对VPA处理24 h的LO2细胞进行定量乙酰化蛋白质组学分析,检测VPA对脂代谢尤其是脂肪酸氧化代谢相关蛋白乙酰化水平的影响。在VPA致小鼠和细胞肝毒性模型中,分析VPA对SIRT3表达的影响;通过小鼠肝脏组织病理学鉴定、肝功能相关生化指标的测定,定量脂质组学对脂质成分含量和酰基肉碱谱的测定、氧化应激指标的测定、检测相应脂肪酸β-氧化酶乙酰化水平等手段,探究由小檗碱介导的SIRT3的激活对VPA致肝毒性的保护作用。结果:1.与CON组相比,ALF组的各类酰基肉碱浓度均有所增加（P＜0.01）。与NLF组相比,ALF组LCACs、VLCACs、OH-ACs和DC-ACs显著增加,采用OPLSDA模型对ALF组患儿血清差异酰基肉碱成分进行分析,最终筛选出12种差异酰基肉碱成分,其中5种为LCACs,3种为OH-ACs,2种是VLCACs。2.VPA剂量依赖性下调与酰基肉碱代谢相关的酶,其中以CPT1A、CPT2及LCAD表达水平变化最为明显（P＜0.01）。3.非诺贝特通过激活PPARα可显著改善VPA致肝毒性小鼠血浆中的各类脂质蓄积,并显著降低血浆中酰基肉碱浓度,减轻VPA致肝脏脂肪变性。PPARα的激活可显著增加其下游靶基因的表达,包括CPT1A,CPT2和LCAD,此外,在VPA诱导的肝毒性LO2细胞中的MDA水平增加,Gsta2、Gsta4、Gstm3和Gpx2的表达水平显著增加（P＜0.01）。细胞实验表明,LCACs可以通过提高Gsta2和Gstm3的表达而导致氧化应激。这些证据表明,PPARα的激活可以通过调节脂肪酸β-氧化来保护VPA引起的肝损伤。4.利用TMT定量乙酰化蛋白质组学技术,共分离出1829个蛋白质,发现了1751个修饰蛋白,发现了4191个独特的赖氨酸乙酰化位点,表明大多数蛋白都被乙酰化。在乙酰化的蛋白质中,46.72%拥有一个以上的位点,这表明有可能存在多个TMT调节位点。其中可准确定量的1829个位点中,165个位点有变化,其中上调为113个,占68.4%。VPA作为HDACs抑制剂,可能导致113个位点上出现选择性的高乙酰化,根据KEGG数据库对所有鉴定到的参与脂质代谢的蛋白质数目进行统计,共鉴定到99个发生乙酰化修饰的蛋白质,其功能包括参与脂肪酸合成、分解、氧化、胆固醇生物合成、甘油三酯代谢等,其中脂肪酸氧化相关蛋白数目最多为25个,约占脂质代谢相关蛋白数目的1/4。继续对KEGG代谢通路中参与脂肪酸氧化蛋白的乙酰化水平进行分析,其中有3个蛋白发生显著上调,分别是ACSL4、HADHA和VLCAD。在VPA致肝毒性小鼠和细胞中SIRT3表达水平均下降,且呈明显的剂量依赖性（P＜0.01）。发现小檗碱（BR）能显著上调LO2细胞中SIRT3的表达,从而下调HADHA的乙酰化水平（P＜0.01）。敲除SIRT3后,BR对HADHA的乙酰化水平无影响（P＞0.05）。BR可降低VPA致肝毒性小鼠血浆中总脂质、TG与PE含量（P＜0.05）。与CON组相比,VPA1m M的LO2细胞HO-1、Nrf2表达明显降低（P＜0.05）,而经BR（20μM）处理后,HO-1、Nrf2表达上调（P＜0.05）。结论:1、VPA致肝功能异常癫痫患儿血清酰基肉碱谱发生改变,筛选出的差异成分主要为LCACs、VLCACs、OH-ACs和DC-ACs;2、VPA可剂量依赖性抑制酰基肉碱代谢相关基因的表达,进而干扰酰基肉碱稳态,另外,VPA能显著下调PPARα的表达,其介导的脂肪酸β-氧化的全面受损可能参与了VPA致肝毒性的发生。3、VPA通过PPARα信号传导抑制了脂肪酸β-氧化酶的基因和蛋白表达,导致了脂肪酸β-氧化、氧化应激和特异性酰基肉碱的积累。非诺贝特通过激活PPARα进而调节脂肪酸β-氧化基因（包括CPT1A、CPT2和LCAD）来改善脂肪性肝损伤。PPARα的激活可减少VPA引起的多种成分的脂质和酰基肉碱蓄积,改善脂肪性肝损伤。这些研究结果支持PPARα激动剂可能成为VPA诱导的肝脏毒性的潜在保护剂4、首次发现VPA对SIRT3的抑制作用,BR通过激动SIRT3介导的HADHA的去乙酰化,来减轻VPA对脂肪酸β-氧化的抑制作用,同时BR还通过激活Nrf2/HO-1信号通路改善氧化应激、减少VPA引起的脂质和酰基肉碱积累等途径改善VPA致肝毒性,为VPA肝毒性的机制研究提供新的可能。