论文部分内容阅读
目的:脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,约占脑肿瘤的50%（Hofer S,et al.Gliome im Erwachsenenalter–Onkopedia,Berlin 2018）。即使采用手术联合放化疗,患者预后仍然不容乐观,特别是恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤（GBM）,患者的中位生存期只有14个月1。虽然较低级别胶质瘤（WHO II,WHO III）患者的预后优于胶质母细胞瘤（GBM）患者,但许多较低级别胶质瘤（LGG）会逐渐进展至更高等级肿瘤,导致患者生存率下降[2]。目前认为IDH突变是胶质瘤基因改变的早期事件,并对胶质瘤前体细胞有广泛影响[3],白细胞趋化性的下调,引起肿瘤相关免疫系统的抑制[3,4]。然而,相关的分子机制仍然知之甚少,因此在该领域的更广泛的研究可以提供改进诊断和治疗的新方案5,6。我们通过分析在IDH突变肿瘤早期即发生变化并且影响患者预后的免疫基因所参与的生物学过程,寻找胶质瘤的新诊断治疗靶点。研究方法:1、利用数据库信息探索IDH两型胶质瘤免疫微环境差异利用CGGA及TCGA数据库中的RNA-seq数据筛查IDH两型胶质瘤中差异表达的免疫基因。将胶质母细胞瘤（GBM）和较低级别胶质瘤（LGG）肿瘤分开分析,以排除两者免疫微环境的差异。分析各亚组中IDH突变组和IDH野生组中表达差异的免疫基因（T检验,校正p值<0.01）,探索各组中差异表达基因涉及的生物学通路。2、探索胶质瘤发生发展早期受IDH状态影响的免疫基因,分析其对预后的影响。将TCGA数据库及CGGA数据库中GBM、LGG组中与IDH状态有关的差异表达基因做交集,目的是为了确定差异的稳定性及找出胶质瘤早期改变的免疫微环境。将该基因集做生存分析（R语言,COX分析）,找到影响预后的基因。3、发现受IDH影响的基因-ISG20,探索其在胶质瘤进展过程中的具体作用。通过对目标基因集的生存分析,发现只有干扰素刺激基因产物20（ISG20）与患者预后相关。分析ISG20在不同亚型胶质瘤中的表达分布,包括患者年龄,性别,肿瘤级别,IDH状态分型等。探讨ISG20水平对各亚组患者生存时间的影响,找到其在胶质瘤进展中发挥的作用。4、探索ISG20相关的免疫学过程。在全部转录基因中分析与ISG20表达水平相关的基因,进行GO分析（http://david.abcc.n-cifcrf.gov/,Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery DAVID v6.8;http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）,从而找到ISG20相关的免疫通路及生物学过程,利用基因集富集分析（GSEA）及基因集变异分析（GSVA）验证免疫相关通路富集结果。5、探索ISG20相关的富集免疫细胞。利用GSVA分析与ISG20水平有关的免疫细胞。收集2017年1月至2018年3月期间内在中国医科大学附属第一医院神经外科诊断胶质瘤并手术切除患者43例,包括WHO II级胶质瘤19例,WHO III级胶质瘤12例,WHO IV级胶质瘤12例。取肿瘤标本行免疫组化染色,验证ISG20水平与肿瘤浸润免疫细胞组成的关系。6、探索ISG20与细胞因子关系。在TCGA、CGGA数据库中探索细胞因子与ISG20水平的关系,讨论导致免疫细胞微环境差异的机制。结果:1、IDH野生型胶质瘤免疫基因过表达增多,多种免疫通路被激活。经分析TCGA数据库及CGGA数据库结果均发现,IDH野生型胶质瘤中表达上调的免疫基因均较IDH突变型胶质瘤中多。在GBM和LGG肿瘤中均发现,IDH野生型肿瘤中上调的免疫基因明显增多（t test,p<0.05;SAM,FDR<0.01）。CGGA数据库提示在LGG中,有43个基因在IDH突变型肿瘤中表达上调,有337个基因在IDH野生型肿瘤中上调。GBM亚群中,有106个基因在IDH突变型胶质瘤中上调,406个基因在IDH野生型中上调。TCGA数据库中,LGG亚群中IDH突变型和野生型上调的基因分别有150个和433个。GBM中,IDHmut有22个基因、IDHwt有208个基因表达上调。经GO分析发现,IDH野生型肿瘤与较多的免疫学过程有关。2、ISG20水平在胶质瘤早期受IDH突变影响,与患者预后相关。我们发现在两个数据库中的LGGs中IDHwt型胶质瘤同时有293个表达上调基因,IDHmut型胶质瘤中同时有43个表达上调基因;在GBM中,IDHwt型胶质瘤同时上调的基因有82个,IDHmut型胶质瘤中共有的上调基因16个。而且,我们发现在这些上调基因中,IDH突变型胶质母细胞瘤和较低级别胶质瘤中有12个免疫基因始终过表达,IDHwt型胶质母细胞瘤及较低级别胶质瘤中有71个免疫基因稳定过表达。在这些基因中,只有ISG20基因会影响患者生存时间。免疫组化结果提示ISG20在IDH野生型肿瘤中高表达。3、ISG20高表达与肿瘤恶性程度相关,与患者预后不良有关。通过分析各级别胶质瘤中不同IDH状态下的ISG20表达水平,发现ISG20水平随着肿瘤级别升高而升高,并且,相同胶质瘤WHO分级中IDH野生型胶质瘤中ISG20水平上调。多因素COX回归分析提示ISG20是胶质瘤中独立于年龄、性别、肿瘤级别、放化疗辅助治疗,IDH、1p9q及MGMT启动子甲基化状态的影响患者预后的因素。分析各级别胶质瘤中ISG20表达水平与胶质瘤患者生存时间发现高表达ISG20的胶质瘤患者总生存期缩短。4、ISG20与多种免疫通路激活有关。ISG20与固有免疫应答,炎症反应,T细胞激活,抗原加工和提呈,造血细胞谱系,白细胞迁移,细胞因子-细胞因子受体相互作用,溶酶体激活,和I型、II型IFN信号通路相关。同时,GSEA与GSVA分析结果提示ISG20与固有免疫反应调节和激活,基于免疫球蛋白超家族结构域构建的免疫受体的体细胞重新组合的适应性免疫应答,抗原加工和MHC I类肽抗原提呈,T细胞增殖调节和病毒防御反应相关。5、ISG20与胶质瘤局部巨噬细胞及中性粒细胞聚集,T细胞及其亚群被抑制有关。随着ISG20水平的增高,胶质瘤局部微环境中单核来源的巨噬细胞及中性粒细胞聚集增多,T细胞及T细胞亚群（中央记忆性T细胞,滤泡辅助性T细胞）水平明显下降。6、ISG20与细胞因子、免疫抑制因子PD1、PD-L1、CTLA4水平有关。ISG20高表达胶质瘤中CCL2,CCL5,CCL23,CCL26,CCR1,CCR2,CCR7,CCRL2,CXCL16,CXCR4和CXCR6水平升高,同时免疫抑制因子PD1、PD-L1、CTLA4水平升高。结论:IDH野生型胶质瘤局部免疫应答增强,其中ISG20表达水平的升高与胶质瘤患者预后不良有关,ISG20与多种免疫通路的激活,CXCR4、CCL2、CCR2、CCL5等多种免疫因子聚集,PD1/PDL1及CTLA4的升高,肿瘤局部单核来源的巨噬细胞、中性粒细胞的聚集,T细胞及其相关亚群等适应性免疫细胞减少密切相关,与抗原提呈过程受阻,胶质瘤细胞的免疫逃逸相关。