【摘 要】
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棉酚是限制棉粕在养殖业应用的主要因素,筛选高效棉酚降解菌是解决棉粕利用问题的有效方法。本实验室前期研究表明,棉酚降解微生物的过氧化氢酶（catalase,CAT）基因的表达受到棉酚的诱导后显著上调。为此,拟在前期工作基础上,首先克隆CAT基因,利用基因敲除技术,研究CAT基因在红平红球菌降解棉酚代谢途径中的作用。本试验以醋酸棉酚为唯一碳源,从棉花种植土壤中筛选得到一株能够利用棉酚的菌株,经16S
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棉酚是限制棉粕在养殖业应用的主要因素,筛选高效棉酚降解菌是解决棉粕利用问题的有效方法。本实验室前期研究表明,棉酚降解微生物的过氧化氢酶（catalase,CAT）基因的表达受到棉酚的诱导后显著上调。为此,拟在前期工作基础上,首先克隆CAT基因,利用基因敲除技术,研究CAT基因在红平红球菌降解棉酚代谢途径中的作用。本试验以醋酸棉酚为唯一碳源,从棉花种植土壤中筛选得到一株能够利用棉酚的菌株,经16S r RNA鉴定为红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）,命名为RE。以该菌株发酵棉粕,棉粕中游离棉酚（Free gossypol,FG）的含量降低了87.46%,总棉酚（Total gossypol,TG）含量降低了53.46%。红平红球菌野生菌RE CAT的AKD95758基因经CRISPR/cas9敲除后获得CAT基因缺失突变株ΔRE,突变株ΔRE的CAT基因扩增片段大小为197 bp,野生菌RE的CAT基因的扩增片段大小为1 462 bp。生长曲线试验结果表明,在不同碳、氮源培养基、温度、p H条件下,野生菌RE和突变株ΔRE在24 h生物量无显著差异（P>0.05）。接种量为1%、2%、3%时,野生菌RE和突变株ΔRE在24 h的生物量无显著差异（P>0.05）;但是接种量为4%和5%时,野生菌RE的24 h生物量显著高于突变株ΔRE的生物量（P<0.05）。CAT酶活测定结果表明,经LB培养基培养的野生菌RE的CAT酶活为14.50,突变株ΔRE的CAT酶活为8.45,CAT活性显著性降低（P<0.05）。经棉酚培养基培养的野生菌RE的CAT活性为16.73,相较于LB培养基培养的野生菌RE的CAT酶活显著升高（P<0.05）;突变株ΔRE的CAT活性为9.61,相较于LB培养基培养的突变株ΔRE的CAT酶活显著升高（P<0.05）。CAT基因表达量测定结果表明,经棉酚培养基培养后野生菌RE的AKD95758基因和AKE00039基因的相对表达量显著高于LB培养基培养的野生菌RE的表达量（P<0.05）;而且棉酚培养基中的突变株ΔRE的AKE00039基因的相对表达量也显著高于LB培养基中突变株ΔRE的表达量（P<0.05）。但是,LB培养基中的野生菌RE和突变株ΔRE的AKE00039基因的相对表达量无显著差异（P>0.05）;经棉酚培养基培养后的野生菌RE和突变株ΔRE的AKE00039基因的相对表达量亦无显著差异（P>0.05）。棉粕发酵试验中,设置A组（1%的RE）、B组（1%的ΔRE）、C组（1%的RE+333 U/100 g过氧化氢酶）、D组（1%的RE+666 U/100 g过氧化氢酶）、E（1%的ΔRE+333 U/100 g过氧化氢酶）、F组（1%的ΔRE+666 U/100 g过氧化氢酶）、H组（333 U/100 g过氧化氢酶）、G组（666 U/100 g过氧化氢酶）。结果表明,A组中FG和TG的降解率（87.82%和54.37%）均显著高于B组（78.58%和47.53%）（P<0.05）;C和D组、E和F组的FG和TG的降解率分别较A、B组均有所提高。与未发酵棉粕相比,A组粗蛋白含量提高19.30%,B组粗蛋白含量提高18.13%;A组酸性洗涤纤维含量降低12.79%、B组酸性洗涤纤维含量降低11.16%;A组中性洗涤纤维含量降低17.33%、B组中性洗涤纤维含量降低16.30%。综上所述,CAT基因在野生菌RE降解棉酚的过程中起到重要作用,但作用机理如何,有待进一步研究。
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