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第一部分 研究背景： 近年来，人们发现许多疾病与基因转录调控区的突变有关，基因转录调控与人类疾病关系的研究引起了广泛的关注。真核生物转录调控涉及核心启动子、顺式作用元件和转录因子。位于人 SCN1A基因5′非翻译区常用的非编码外显子有1a、1b、1c，本课题组鉴定的主要为h1u、h2u、h3u，其中h1u、h2u分别相当于Martin MS等报导的1a和1c，h3u则紧邻SCN1A编码区第1号外显子。日本学者报导的人SCN1A基因5′非翻译区的非编码外显子则主要有hA、hB、hC和hD，分别与Martin MS等报导的1a、1b、1c和1g相当。在人脑组织所鉴定的SCN1A转录本中，含有1a/h1u的占大部分（约30-69％，均由1a/h1u起始后直接联接到编码区第1号外显子）。启动子区一般位于转录起位点上游1kb以内，在这些区域分布有大量的与启动子元件序列一致的位点。因此，1a/h1u上游1kb以内的序列在SCN1A转录调控方面可能发挥了重要作用，位于该范围内的SNPs可能影响转录进而干扰SCN1A的表达。 研究目的： 对SCN1A5′UTR3个SNPs进行进一步研究，明确 SCN1A5′UTR是否存在DS相关的单倍型。 第二部分： 研究背景： 近年来，人们发现许多疾病与基因转录调控区的突变有关，基因转录调控与人类疾病关系的研究引起了广泛的关注。真核生物转录调控涉及核心启动子、顺式作用元件和转录因子。位于人 SCN1A基因5′非翻译区常用的非编码外显子有1a、1b、1c，本课题组鉴定的主要为h1u、h2u、h3u，其中h1u、h2u分别相当于Martin MS等报导的1a和1c，h3u则紧邻SCN1A编码区第1号外显子。日本学者报导的人SCN1A基因5′非翻译区的非编码外显子则主要有hA、hB、hC和hD，分别与Martin MS等报导的1a、1b、1c和1g相当。在人脑组织所鉴定的SCN1A转录本中，含有1a/h1u的占大部分（约30-69%，均由1a/h1u起始后直接联接到编码区第1号外显子）。启动子区一般位于转录起位点上游1kb以内，在这些区域分布有大量的与启动子元件序列一致的位点。因此，1a/h1u上游1kb以内的序列在SCN1A转录调控方面可能发挥了重要作用，位于该范围内的SNPs可能影响转录进而干扰SCN1A的表达。 研究目的： 对SCN1A5′UTR3个SNPs进行进一步研究，明确 SCN1A5′UTR是否存在DS相关的单倍型。 研究方法： 1、单倍型的构建 1）利用haploview4.2软件明确用于构建单倍型的4个SNPs是否属于1个连锁不平衡区域； 2）利用单倍型运算软件Phase2.1得出具体单倍型。 2、构建目标质粒 使用primer5.0软件设计相应引物，引物5′、3′端添加相应酶切位点，PF2、PT2在3′端比PF1、PT1多了77bp的h1u核心序列，PCR时以两条等位基因均含单倍型1型的正常人DNA作为PF1、PF2的模板，扩增PT1、PT2的模板为两条等位位基因均含单倍型2型的DS病人DNA。经酶切后与pGL4.10骨架连接。 3、双荧光素酶活性测定 用构建好的质粒转染HEK-293细胞，使用双荧光报告系统对转染细胞进行荧光素酶活性测定。 4、预测转录因子结合位点 利用TFSEARCH及PROMO软件对SCN1A5′UTR3个SNPs，c.1-76155G>-、rs16851669、rs16851666附近可能存在的转录因子结合位点进行预测。 5、统计学处理 采用SPSS13.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)软件包进行统计分析，DS与正常人单倍型的构成比较使用Fisher精确检验（Fisher’s exact test），双荧光素酶活性测定使用两组独立样本均数t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。 研究结果： 1、单倍型的构成 haploview4.2软件明确用于构建单倍型的4个SNPs，rs16851669C>T，c.1-76155G>-，rs80169419C>T，rs16851666C>T，属于1个连锁不平衡区域。利用单倍型运算软件Phase2.1共构建了4个单倍型，21个DS与正常均以单倍型1型为主，在单倍型的总体构成上，两组之间无明显差别（P=0.06），但单倍型2在病人中占31%左右，约为正常人的2倍，两组之间相差显著（P=0.026）。2、目标质粒的构建 共构建了4个质粒，为F1、F2、T1、T2，均以pGL4.10骨架为载体，分别含PF1、PF2、PT1、PT2目的片段，其中F1、F2为纯合子的单倍型1型，T1、T2为纯合子的单倍型2型。 3、双荧光素酶活性测定 用4个构建成功的质粒与海肾荧光素质粒共转染HEK-293细胞后进行荧光素酶活性测定，结果以均数±标准误的形式表示，并以pGL4.13、pGL4.10分别为阳性及阴性对照。实验共重复3次，每个质粒每次进行8个生物学重复（每个质粒均铺8个孔）。结果显示F1相对阴性对照有弱的荧光素酶活性（P<0.05），其余3个质粒均无活性，且T1较F1活性有明显降低(P<0.001)。 4、预测转录因子结合位点 TFSEARCH预测结果显示rs16851666（h1u-52）C变为T后，其附近多了一转录因子结合位点，其它两个SNPs变化不明显；PROMO预测，结果当h1u-688处为C时预测到2个转录因子结合位点，当该位点为T时预测到10个，当h1u-662为G时未能预测到转录因子结合位点，当G缺失时在h1u-662附近预测到2个转录因子结合位点，当h1u-52为C时仅预测到1个转录因子结合位点，而变为T后可预测到9个。 结论： 1、SCN1A5′UTR单倍型2型可能与DS相关； 2、其机制可能与降低`h1u上游启动子活性有关； 3、单倍型2型对h1u上游区启动子活性的影响可能与其增加该区转录因子结合位点有关。