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农药在现代农业生产中占据着不可替代的位置,是农作物稳产、高产的保障;但同时,农药残留对人类健康带来很多负面影响,而其对生殖的影响也越来越引起人们的重视。作为目前世界上使用最广泛的农药之一,毒死蜱（Chlorpyrifos,CPF）具有高效、广谱、中等毒性等特点;但其残留导致生殖毒性的作用机制并不清楚。此外,研究还发现蔬菜、水果、茶叶和葡萄酒等食物中广泛存在的化合物,如槲皮素、根皮素、儿茶素和维生素C等具有抗氧化、清除自由基等多种生物学功能。因此,本研究通过体外和体内（腹腔注射或日粮添加）试验研究CPF诱导的小鼠雄性生殖毒性作用,初步探究其致毒机理;同时,通过添加活性物质（槲皮素、根皮素、儿茶素和维生素C）,研究其对CPF诱导的生殖损伤有无缓解作用;以期为雄性不育的治疗提供理论依据。本研究获得了如下重要研究结果:1.体外试验-毒死蜱诱导的雄性生殖毒性研究本研究,探究了CPF的添加对小鼠精原细胞系（GC-1）、支持细胞系（TM4）和间质细胞系（TM3）的毒性作用及其作用机制。细胞形态学观察、细胞活力检测、细胞计数和q PCR结果表明:随着培养基中CPF添加浓度的增加,GC-1细胞的数量和细胞活力逐渐降低,细胞增殖相关基因CCND1（编码周期蛋白Cyclin D1）和CCNE1（编码周期蛋白Cyclin E1）的表达逐渐降低,促凋亡基因p53,p21CIP,Puma,Caspase 9和Caspase 3的表达逐渐升高。流式细胞仪检测和TUNEL染色结果表明:随着培养基中CPF浓度的增大,TUNEL阳性细胞的数量逐渐增加,晚期凋亡细胞的比例逐渐增多。Western blot结果表明:培养基中CPF的添加会导致GC-1细胞中抑凋亡蛋白BCL2表达下调,BAX/BCL2表达比值的升高,促凋亡蛋白Caspase 9表达上调。对于TM4和TM3细胞,随着培养基中CPF浓度的增加,细胞数量和细胞活力逐渐降低,促凋亡基因的表达逐渐升高。与GC-1细胞不同的是,随着培养基中CPF添加浓度的增加,TM4细胞中BAX/BCL2表达比值的升高是由于促凋亡蛋白BAX表达的上调引起的。进一步的机制研究表明,CPF的添加促进了AMPK的磷酸化,降低了线粒体的膜电位,上调了细胞中活性氧（ROS）和脂质过氧化（MDA）的水平,进而促进了细胞的死亡。2.体内试验-毒死蜱诱导的雄性生殖毒性研究本研究,通过腹腔注射或日粮中添加CPF,探究了其对F0或F1代小鼠雄性生殖的影响。通过每天注射不同剂量CPF（3 mg/kg、6 mg/kg和12 mg/kg）到小鼠腹腔,持续注射35 d后采样检测。与对照组相比较,处理组小鼠睾丸组织的形态和各个组织的脏器指数无显著差异。其中,12 mg/kg组在腹腔注射18 d时,1只小鼠死亡,其余小鼠行为迟缓;该处理组中,小鼠睾丸组织部分曲细精管内生殖细胞受到损伤,细胞缺失,形态学发生改变。在日粮中添加不同浓度CPF饲喂F0代小鼠80 d后,睾丸组织无明显形态学改变。q PCR结果表明,随着日粮中CPF添加浓度的增加,类固醇激素合成相关基因的表达在睾丸组织及其他脏器组织逐渐降低。F1代小鼠饲喂含CPF日粮3 w或4 w后,各组F1代小鼠的体重和脏器重量虽无显著差异,但与对照组相比较,CPF添加组中类固醇激素合成相关基因的表达发生了改变。上述结果表明,CPF急性中毒或慢性毒性累积均会导致小鼠生殖发育受损。3.活性物质对毒死蜱诱导生殖毒性的缓解研究本研究,为了排除培养基中所添加活性物质对GC-1细胞本身的正常生长和代谢的影响,首先筛选了槲皮素、根皮素、儿茶素和维生素C在GC-1细胞中的有效添加浓度范围。细胞形态学观察、细胞活力检测、细胞计数和细胞内ROS水平检测结果表明,这四种活性物质在GC-1细胞中的有效添加浓度为槲皮素≤50μM,根皮素≤25μM,儿茶素≤500μM和维生素C≤750μM。随后,利用筛选后的活性物质的有效添加浓度,与25μM（半致死剂量）CPF共同处理细胞,研究活性物质对CPF诱导的生殖损伤有无缓解作用。q PCR结果表明:与25μM CPF单独处理组相比,不同浓度的活性物质虽然在表型上并未显著恢复CPF诱导的GC-1细胞损伤,但25μM槲皮素、1μM根皮素、50μM儿茶素和250μM维生素C均可在转录水平降低25μM CPF处理的GC-1细胞中促凋亡基因Caspase 3和Caspase 9的表达,提示这4种活性物质具有缓解CPF诱导的GC-1细胞凋亡的作用。综上,本研究首次探究了CPF体外诱导GC-1、TM4和TM3细胞的毒性作用及其作用机理;CPF诱导这两种细胞凋亡的机制为促进AMPK的磷酸化,降低线粒体的膜电位,上调细胞中ROS和MDA的水平,进而促进了细胞的死亡。此外,体内试验（腹腔注射或日粮中添加CPF）表明,CPF可下调F0和F1代小鼠睾丸、脾脏和肺脏中类固醇激素合成相关基因的表达。25μM槲皮素、1μM根皮素、50μM儿茶素和250μM维生素C均可在转录水平降低25μM CPF处理的GC-1细胞中Caspase 3和Caspase 9的表达,提示这四种活性物质具有缓解CPF诱导的GC-1细胞凋亡的作用。