论文部分内容阅读
深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes,DSE)是一类广泛定殖于植物根内的内生真菌。实验室前期分离得到了一株重金属高度耐受的DSE菌株嗜鱼外瓶霉(Exophialapisciphila,H93),转录组分析发现Cd2+胁迫上调了褪黑素合成酶基因(TDC、SNAT、ASMT)的表达。褪黑素(Melatonin)是一种古老的抗氧化小分子,在提高生物体的重金属胁迫耐性上发挥着重要作用。为探究H93菌株中褪黑素与重金属耐性之间的联系,首先利用施加外源褪黑素的方式探究褪黑素介导H93菌株的重金属耐性;然后对H93菌株褪黑素合成酶基因进行生物信息分析;探讨在重金属(Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+)胁迫下H93菌株褪黑素合成水平及其合成酶基因的响应模式;用大肠杆菌诱导表达体系对H93两个褪黑素合成酶基因EpTDC、EpASMT进行了诱导表达以获取其酶活特征,构建了E这TDC、EpASMT大肠杆菌和拟南芥过表达株,以异源过表达的方式研究了褪黑素合成酶基因与重金属耐性之间的关系及可能的机制。研究主要结果如下:1.外源褪黑素主要通过调控H93重金属吸收和转运系统、或直接鳌合重金属离子,从而减少Cd2+、Zn2+、Pb2+在H93菌株体内的积累。外源褪黑素的施加降低了Cd2+、Zn2+、Pb2+胁迫下H93丙二醛和超氧阴离子的含量,减缓了重金属造成的氧化胁迫。外源褪黑素还提高了 Pb2+、Zn2+胁迫下H93菌株体内的超氧化物歧化酶的活性,进而缓解了氧化胁迫。2.EpTDC、EpSNAT、EpASMT保守结构域分析表明三种酶都含有已鉴定相关酶的保守结构域,表明它们可能参与褪黑素的合成。亲疏水分析、跨膜结构分析、N端序列信号肽分析表明三个褪黑素合成酶基因编码的蛋白是亲水蛋白而不是跨膜蛋白。亚细胞定位预测显示,EpTDC定位于细胞质,EpSANT定位于细胞质,EpASMT定位于细胞质。进化系统发育树的分析表明,H93褪黑素的合成酶聚于真菌一支并与动植物分开,表明其可能独立进化。3.H93褪黑素及其合成酶基因均能响应重金属(Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+)胁迫,EpTDC与EpSNAT的表达量变化与褪黑素的含量变化一致,并且Cd2+、Cu2+、Zn2+胁迫初期(2d)时褪黑素含量显著升高。这表明H93菌株较强的重金属耐性与褪黑素及其与合成酶基因及其表达密切相关。4.通过对大肠杆菌诱导表达系统得到的EpTDC和EpASMT粗酶进行酶活性分析,结果初步表明其可催化褪黑素中间产物色胺(tryptamine)和5-甲氧基色胺(5-methoxytryptamine)的生成。5.异源过表达进一步验证了褪黑素合成酶基因能提高宿主的重金属耐性,可能通过减少重金属在拟南芥体内的积累实现。EpTDC、EpASMT的导入提高了重金属胁迫下大肠杆菌的OD600、拟南芥根长和鲜重,证明EpTDC、EpASMT在提高H93菌株重金属耐性中发挥着重要作用。在40 mg/kg Cd2+胁迫下EpTDC、EpASMT的导入降低了拟南芥根和植株的Cd2+含量,表明两个基因可能通过降低重金属含量提高转基因拟南芥的重金属耐性。