翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)在真核生物体内广泛分布并在众多细胞过程中发挥着重要作用,通过对其参与的不同细胞信号通路的研究,TCTP的一些生物学功能得以推测或明确,然而,TCTP在豆科植物共生固氮过程中的作用尚不为人知。本实验室在前期对刺槐共生结瘤分子机制的研究中分离到一个TCTP同源序列,Rpf41,该基因在刺槐共生互作过程中显示出动态表达的趋势,接种根瘤菌15天时在刺槐根部的表达量达到最大值,但其后在成熟根瘤中的表达量明显下降。本研究利用RACE方法获得了该基因的cDNA全长并对其进行了亚细胞定位,同时通过RNA干扰(RNAi)、基因过表达技术对Rpf41在刺槐共生根瘤形成过程中的功能进行了分析鉴定。研究内容及得到的结果简述如下:1、Rpf41 cDNA全长的获得采用cDNA末端快速扩增法(RACE)技术,提取刺槐接种根瘤菌后第15天根中的总RNA为模板,分别构建5’和3’RACE cDNA文库;根据实验室前期已经获得的Rpf41基因片段信息设计基因特异性引物GSP1,GSP2,扩增并获得刺槐Rpf41基因的5’和3’序列,通过重叠区的比对获得Rpf41基因全长cDNA序列;对其保守结构域进行初步分析,并与其它植物来源的同源序列进行比较,预测其功能。2、Rpf41亚细胞定位载体的构建及蛋白的定位分析构建Rpf41基因亚细胞定位载体,通过洋葱表皮细胞瞬时表达的方法研究了该蛋白在洋葱表皮细胞中的分布。结果显示,Rpf41蛋白在细胞膜、细胞核、细胞质及细胞骨架上都有分布,为该基因功能的进一步研究提供依据。3、Rpf41 RNA干扰载体、过量表达载体的构建及其结瘤表型分析构建Rpf41 RNA干扰载体和过量表达载体,通过发根农杆菌介导的植物受体转化实验将重组载体导入刺槐根部,观察其对刺槐植株发育,根毛的形成,根瘤菌侵染过程以及根瘤形成的影响。我们以转化了空载体和不含任何载体的刺槐植株为对照,RT-PCR及qRT-PCR检测目的基因的沉默情况。结果表明:在接种后不同天数的RNAi根中Rpf41的表达被有效沉默;过量表达植株中Rpf41基因表达量均升高。Rpf41 RNAi刺槐表现为植株矮小、根毛粗短稀疏,结瘤数目明显下降且多为白色无效根瘤。接种后28天根瘤的石蜡切片观察结果表明:干扰后的植株根瘤中的侵染细胞在数目及密集程度上远远不及对照根瘤,并且RNAi根瘤的发育停留在II区,没有检测到III区(成熟的固氮区);透射电镜观察结果表明,RNAi根瘤细胞不含类菌体或仅有少量的类菌体,环类菌体空间增大,在有些根瘤细胞中,类菌体严重皱缩变形,表现出早衰的迹象。Rpf41过量表达结果显示:导入Rpf41过表达重组载体的实验组和对照组相比,植株的生长表型、根瘤数目、形态及内部结构都没有发生明显的变化。