背景:钙化性主动脉瓣膜疾病（calcific aortic valve disease,CAVD）是老年人最常见的瓣膜疾病之一,主动脉瓣膜置换术是唯一有效的治疗手段,但手术风险高且近1/3的患者不能耐受,因此探究其发生机制,进行早期诊断及干预尤为重要。颗粒蛋白前体（Progranulin,PGRN）是重要的炎症调控因子,在前期研究中发现在钙化瓣膜组织中PGRN降解片段显著增加,且自噬水平异常,因此探索PGRN/GRN、自噬对瓣膜钙化的调控机制有助于揭示CAVD发生的分子机制,发现CAVD潜在的干预靶点和诊断标志物。目的:1.首先探究PGRN/GRN、自噬与主动脉瓣膜钙化之间的相关性;2.探究PGRN和其降解片段是否通过调控自噬来影响主动脉瓣膜间质细胞（valvular interstitial cells,VICs）成骨表型转化及其具体机制;3.进一步明确在主动脉瓣膜钙化过程中PGRN降解增多的关键调节点,为CAVD的早期诊断及干预提供理论依据。方法:本研究分为三个部分:1.探索PGRN/GRN、自噬与主动脉瓣膜钙化之间的临床相关性。采用PCR、Western blot和免疫组化等方法检测non-CAVD组和CAVD组,以及钙化组和钙化旁组瓣膜组织中的PGRN、自噬指标LC3、p62以及成骨指标RUNX2、OPN的表达水平,并进行相关性分析;提取猪主动脉瓣膜间质细胞并进行表型鉴定。体外诱导VICs钙化,观察PGRN/GRN、自噬及VICs成骨表型转化指标的表达,进一步验证PGRN/GRN、自噬及VICs成骨表型转化之间的相关性。2.探索PGRN及其短片段对自噬的调节作用及其机制。体外添加PGRN重组蛋白,在正常和钙化诱导两种条件下,通过Western blot和转染GFP-LC3病毒检测VICs自噬水平的变化。用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红S（ARS）染色分别检测PGRN对VICs早晚期成骨分化的影响。PGRN激活VICs自噬水平后,加入自噬小体形成抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin,WORT）和自噬溶酶体形成抑制剂巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1,Baf A1）,通过Western blot和转染GFP-LC3病毒验证PGRN对自噬的具体调控过程。在正常和钙化诱导条件下,VICs感染Ad-45KD GRN,通过ALP染色和ARS染色检测其对VICs早晚期成骨分化的影响;Western blot检测自噬指标LC3、p62及成骨指标RUNX2和OPN的表达水平,检测45KD GRN对自噬的调控作用。Western blot检测钙化瓣膜中活化的信号通路以及PGRN和45KD GRN在VICs中作用的信号通路,并通过加入相关通路的激动剂或抑制剂,进一步验证PGRN和45KD GRN对自噬的调控机制。在GRN-/-小鼠的原代成纤维细胞中,验证PGRN对自噬的调控作用。细胞免疫荧光检测PGRN对RUNX2入核的影响。3.对主动脉瓣膜中造成PGRN降解的酶类进行测定,以寻求早期的诊断指标和干预靶点。用PCR和Western blot分析钙化与钙化旁瓣膜组织以及体外钙化诱导条件下VICs中PGRN降解酶的表达差异,从中选出差异最显著的中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase,NE）。在体外加入NE特异性抑制剂Alvelestat,通过Western blot检测其对PGRN的降解、自噬指标、VICs成骨表型转化及相关信号通路的作用。结果:1.与非CAVD组相比,CAVD组中RUNX2的基因表达显著上调。蛋白水平检测显示:与钙化旁组相比,钙化组瓣膜组织中RUNX2、OPN显著升高,同时PGRN的降解片段45KD大小的GRN片段显著增高,且p62表达显著上调。相关性分析结果显示45KD GRN的增多以及自噬水平的异常与主动脉瓣膜钙化呈正相关。分离的原代猪VICs表型鉴定结果显示Vimentin、α-SMA阳性,同时CD31阴性。在钙化诱导条件下,VICs细胞的PGRN降解增多、自噬水平受阻,同时RUNX2、OPN的基因和蛋白表达上调,ALP染色和钙盐沉积增强,进一步证实PGRN的降解及自噬水平异常与VICs的成骨表型转化密切相关。2.在正常和钙化诱导条件下,PGRN重组蛋白可显著激活VICs自噬水平,抑制RUNX2、OPN的蛋白表达,抑制ALP染色和钙盐沉积。加入WORT阻断自噬后,PGRN对自噬的活化受到显著抑制且其对RUNX2的下调作用也得到部分逆转,证实PGRN可通过激活自噬抑制VICs的成骨表型转化。加入自噬溶酶体形成抑制剂Baf A1后,Baf A1+PGRN组LC3 Ⅱ的蓄积和自噬小体均明显高于单独的Baf A1组,证实PGRN可通过促进自噬小体的形成上调自噬水平。而体外构建的45KD GRN则可以明显下调LC3 Ⅱ,同时使p62增高,并且促进VICs成骨表型转化指标上调,使ALP染色和钙盐沉积增强。自噬相关信号通路的检测发现在钙化部位,p-AKT和p-mTOR的水平均显著升高。而体外添加PGRN可以在60min和2h时显著抑制AKT的磷酸化,24h时抑制mTOR的磷酸化。加入AKT通路的激动剂后,PGRN对自噬的激活作用被逆转,同时OPN、RUNX2有所上调。45KD GRN则可以显著上调p-mTOR,加入mTOR通路抑制剂-雷帕霉素（Rapa）后,45KD GRN对自噬的抑制及对VICs成骨表型转化的促进作用得到逆转。这部分结果证实全长PGRN可以通过抑制AKT-mTOR通路来激活自噬抑制VICs的成骨表型转化,而45KD GRN则通过激活mTOR通路发挥相反作用。在GRN-/-的MEFs中,加入PGRN使mTOR通路被显著抑制,同时自噬水平上调,成骨指标下调,进一步证实PGRN通过调控自噬抑制细胞的成骨表型转化。同时,PGRN可以减少RUNX2的核定位。3.钙化瓣膜组织中PGRN降解酶类NE和MMP9在基因及蛋白水平均显著上调。体外VICs诱导钙化过程中,蛋白酶类也显著上调,其中以NE增加最为显著,加入了NE的特异性抑制剂Alvelestat后,全长PGRN增多,45KD GRN减少,RUNX2明显下调,且p-mTOR明显下调。钙化诱导条件下,加入PGRN及Alvelestat,证实Alvelestat可以增强PGRN对AKT通路及VICs成骨表型转化的抑制,同时增加自噬小体的形成。在GRN-/-的MEFs中,NE抑制剂可以使RUNX2进一步下调。证实NE抑制剂可以增强全长PGRN对AKT-mTOR通路及VICs成骨表型转化的抑制作用。结论:本研究表明PGRN降解增多、自噬异常与主动脉瓣膜钙化之间呈正相关;首次证实全长PGRN可以通过抑制AKT-mTOR通路来激活自噬抑制VICs成骨表型转化,而45KD GRN则通过激活mTOR发挥相反作用;NE抑制剂可增强全长PGRN对AKT-mTOR通路及VICs成骨表型转化的抑制,提示抑制NE可能成为阻止CAVD发生发展的新思路。