藤黄球菌Rpf加速PCE/PCBs高效厌氧脱氯培养物富集及其微生物学机理研究

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多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)组成复杂,性质稳定,是土壤中分布较广泛的持久性有机污染物。微生物对PCBs的代谢降解是土壤PCBs最主要的削减方式,决定PCBs在土壤中的最终残留量。然而,绝大多数微生物均因处于活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态,而限制其降解功能的发挥,成为微生物修复技术应用的瓶颈问题。课题组前期已证明藤黄球菌复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)对PCBs好氧降解微生物的复苏促进作用,但是有关Rpf对厌氧微生物功能菌群的研究尚未开展。PCE常作为替代性电子受体预培养脱氯菌群而富集高效PCBs脱氯培养物。因此,本研究以受PCBs污染的厌氧土壤为研究对象,考察Rpf添加对富集PCE/PCBs脱氯功能菌群的影响,通过PCE和Aroclor 1260脱氯性能、菌群结构、微生物基因等方面揭示Rpf对厌氧脱氯菌群的复苏促进作用。主要研究结果如下:(1)研究藤黄球菌Rpf添加对第1-3代PCE富集培养体对PCE脱氯性能的影响,处理组(添加Rpf)中PCE的残余量(<0.03 mM)显著低于对照组(未添加Rpf)(>0.12 mM)。PCE脱氯符合一级动力学模型,处理组中PCE脱氯速率从0.428/d增至0.792/d,显著高于对照组,表明添加Rpf能促进并加速PCE脱氯。同时,Rpf可显著提高PCE培养体中菌体的生长量。(2)深入研究Rpf添加对第4代Aroclor 1260富集培养体脱氯性能的影响,发现Rpf可显著提高PCBs脱氯速率。处理组和对照组氯原子去除速率分别为2.28μM/d和1.50μM/d。同时,Rpf可显著提高PCBs脱氯程度。50 d后,处理组中高氯代PCBs同系物的摩尔百分比为36.7%,而对照组中仍有59.8%的高氯代未被还原。另外,对处理组和对照组脱氯途径进行了探究,发现各组别脱氯历程均包括脱氯历程H、T、H’和N,主要的脱氯产物为PCB 47、49、52、64、95、99和90/91/101。且两组中主要脱氯位点均为间位(meta)和对位(para),Rpf添加可增强meta氯原子去除。(3)利用Illumina高通量测序研究藤黄球菌Rpf添加对富集培养体中功能菌群的影响,结果表明,Rpf可显著促进PCE/PCBs脱氯关联微生物功能群的富集。处理组中2-4代的Shannon指数分别为6.92、5.58和3.46,而对照组分别为6.07、5.02和2.73。参与PCE/PCBs脱氯的重要菌门Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Euryarchaeota和Chloroflexi在处理组中相对丰度均显著高于相应对照组。PCE/PCBs脱氯菌属Desulfitobacterium、Dehalobacter和Dehalococcoides以及脱氯协同菌属Bacteroides、Desulfovibrio和Methanosarcina在添加Rpf后均被显著富集。另外,利用real-time PCR对各代各组别中的微生物基因丰度进行了对比分析,发现处理组中Bacterial 16S rRNA genes、Archaeal 16S rRNA genes和Dehalococcoides 16S rRNA脱氯基因拷贝数均显著高于相应对照组。(4)将Rpf添加组获得的富集培养体对四种不同典型氯代PCBs(PCBs101、118、138、180)进行脱氯性能测试,同时再次添加Rpf以强化其PCBs脱氯性能。当PCBs浓度为1 mg/L时,处理组PCB各单体的残余量分别为0.18、0.30、0.37和0.41 mg/L,显著低于对照组。随着PCBs浓度增加,各组中的PCBs脱氯效果均呈下降趋势。当PCBs浓度为10 mg/L时,处理组PCB各单体的残余量显著低于对照组,其中PCB 101脱氯的差异尤为显著(处理组vs.对照组:3.00 mg/L vs.5.68 mg/L)。富集培养体PCBs的脱氯途径以meta和para脱氯为主,可知,添加Rpf获得的富集培养体具有较好的PCBs耐受与脱氯性能,且再次添加Rpf也可再次提高富集培养体的脱氯效率,但不会改变其PCBs脱氯途径。本论文研究成果为Rpf强化微生物修复技术在PCBs污染土壤修复中的应用开辟新前景,并为Rpf应用于加速其它典型卤代有机污染物还原脱卤提供理论基础。
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