研究背景莱菔硫烷(Sulforaphane, SF)是从绿花椰菜或绿花椰菜幼芽中提取的一种经葡糖异硫氰酸盐转化的天然化合物,传统上作为预防肿瘤的化学药物。动物实验表明,莱菔硫烷可阻断化学物诱发肿瘤的起始阶段,日常膳食中的莱菔硫烷足以显著降低细胞PhIP2DNA加合物的形成。莱菔硫烷可防止二甲基苯蒽(7,12-dimethyl benz (a) anthracene, DMBA)诱导的小鼠乳腺癌癌前损害和大鼠乳腺肿瘤的发生,使DMBA诱导的SD雌性大鼠肿瘤的发生率降低、肿瘤的数量减少、瘤重减轻、肿瘤生长缓慢。莱菔硫烷通过抑制人、鼠的细胞色素P450和苯并(a)芘与DNA结合,从而改变致癌物代谢。以往的文献证实莱菔硫烷能将前致癌物质转化为致癌物的I相代谢酶,诱导促进致癌物排出的Ⅱ相代谢酶。莱菔硫烷是最有潜力的Ⅱ相酶诱导物,它诱导的Ⅱ相酶基因,如GST和NQ01也依赖于Nrf2。给Nrf2缺失鼠和野生型鼠莱菔硫烷后,用DNA矩阵方法检测鼠小肠中Nrf2依赖基因的表达,结果发现了大量Nrf2调节的解毒酶、抗氧化蛋白和降低毒物毒性的细胞保护蛋白。体内和体外的研究发现,莱菔硫烷刺激Raf-1激酶的活性,表明莱菔硫烷对ARE依赖的Ⅱ相解毒酶的诱导作用受MAPK(mitogen-activated protein kinase)路径的调节,也包括莱菔硫烷对Raf-1激酶的直接刺激和活化作用。莱菔硫烷不能干预AP-1(activator protein1)的转录活性,但是,可以通过增加细胞间信号调节激酶的磷酸化和激酶活性提高AP-1依赖的Ⅱ相酶表达。除了解毒、减毒功能外,莱菔硫烷通过不同的信号通路调控多种细胞活动,包括抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,抑制血管生成和转移。环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)是花生四烯酸代谢过程中重要的限速酶。肿瘤组织COX-2表达增加,在结肠、直肠腺瘤及腺癌、胃癌、胰腺癌等多种癌症中,COX-2蛋白及mRNA水平较正常组织升高。COX-2表达上调与肿瘤的发生密切相关。研究表明,莱菔硫烷可下调鼠巨噬细胞COX-2的表达,其抑制作用发生在转录水平。COX-2启动子区域的顺式作用元件上存在NFκB和C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein)β结合位点,莱菔硫烷主要是通过抑制NFκB的活性而抑制脂多糖诱导的基因表达。另外,莱菔硫烷可引起HT-29细胞凋亡与P53蛋白表达无关,而与bcl-2基因家族中引起细胞死亡的bax过度表达有关。bax是一种胞质蛋白,一部分可转移到线粒体,并引起线粒体释放细胞色素C,最终活化Caspase级联反应引起凋亡。研究发现,bax过度表达能降解cdk (cyclin-dependent kinase)的抑制物P27,进而诱导cdk和caspase的活化。这说明莱菔硫烷可抑制肿瘤发生过程中的多个步骤。肿瘤干细胞假说认为,肿瘤组织由一小部分肿瘤形成和自我更新的肿瘤干细胞和大部分不能形成肿瘤的肿瘤细胞组成。大多数肿瘤组织中均能鉴别出肿瘤干细胞,包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌等。这一假说提示传统上的化疗药物只杀死已分化或分化中的肿瘤细胞,而这些细胞占肿瘤组织的大部分,不能产生新的肿瘤细胞。由于肿瘤干细胞没有受影响,故肿瘤通常出现复发,这提示去除肿瘤干细胞是有效的肿瘤治疗的关键。肿瘤干细胞与肿瘤中大多数量细胞不同,它对化疗药物耐药,并在肿瘤治疗后促进肿瘤转移和复发。包括Wnt/β-catenin在内的多条信号通路被认为参与了正常干细胞和肿瘤干细胞自我更新行为的调控。研究证实Wnt/β-catenin是调控肿瘤干细胞自我更新的关键信号通路之一。miRNA是一种长约21-23个碱基的非编码RNA,在基因表达的转录后水平调控的重要调节子,其主要机制是靶向特异的miRNA序列并抑制其翻译的激活或促进其降解。来自不同实验室的研究表明,miRNA的调控范围非常广泛,包括发育、生存周期、代谢和肿瘤发生。miRNA基因受多种水平调控以应答分化和有丝分裂的激活。一些miRNA表达于某些特定分化细胞,而另一些miRNA则在早期发育过程中特异地表达于干细胞或祖细胞。近年研究表明,miRNA的调控失常与许多肿瘤的发生有密切关系,miRNA可作为肿瘤抑制子或原癌基因并参与肿瘤干细胞的维持与分化。研究目的1.确定莱菔硫烷对肺癌细胞的效应；2.确定莱菔硫烷对体外培养细胞中肺癌干细胞的抑制效果3.确定莱菔硫烷对动物模型中的肿瘤干细胞的抑制效果。4.探讨莱菔硫烷抑制肺癌干细胞自我更新的调控机制。方法1.不同浓度莱菔硫烷(0-20μmol/L)处理H460和H446细胞72h后,采用MTT法检测莱菔硫烷对肺癌细胞生长的抑制作用；不同浓度莱菔硫烷(5和10μmol/L)处理H460细胞72h后,采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测莱菔硫烷对肺癌细胞凋亡的影响。Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白,参与细胞内的信号转导。只有Annexin V被报道可以调控一些PKC的活性。Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸。磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧,即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期,不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面,即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V,即Annexin V-FITC,就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞,呈现红色荧光。对于坏死细胞,由于细胞膜的完整性已经丧失,Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内,与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合,从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。2.采用肿瘤球培养法培养细胞。肿瘤球培养法是利用肿瘤干细胞能在无血清的培养基中悬浮生长,而分化的肿瘤细胞不能在其中存活的特征,最早用于肿瘤干细胞研究的有效方法。肿瘤球内肿瘤干细胞富集,能用各种相关肿瘤干细胞表达标记物鉴定并分离。常规培养的H460细胞经胰酶消化后,离心,1000rpm,2分种,,弃上清。加入3ml无菌PBS,轻柔吹散洗涤细胞沉淀并离心。反复洗涤3次后加入肿瘤球培养基,制备成单细胞悬液。测定细胞浓度并调整细胞密度为1500cells/mL,将单细胞悬液均匀地转移到超低粘附的6孔板内,进行原代肿瘤球培养。分为以下4组：空白组、SF1(1μMol/1), SF2(2μMol/1)和SF5(5μMol/l)。在肿瘤球培养基中加入不同浓度莱菔硫烷(1.0、2.0和5.0μmol/L)处理理H460和H446细胞7天,期间每3-4天换液1次。处理结束后在显微镜下计数肿瘤球形成数量并测定肿瘤球直径。比较各组间的差异以确定莱菔硫烷对原代肺癌细胞肿瘤球形成的影响；对原代培养的肿瘤球再次以accutase酶消化为单细胞悬液,细胞密度调整为800-1000个细胞/ml,重新进行肿瘤球培养,不加入药物处理。7d后计数肿瘤球形成的数量并测量肿瘤球直径。3.莱菔硫烷对肺癌细胞内侧群细胞(Side population cells,SP cells)比例的影响侧群细胞是在应用Hoechst33342染色和荧光激活细胞分选时发现的一小群拒染细胞。已经证实SP细胞具有自我更新、分化和高致瘤性的特征,并且发现其具备干细胞“永生”和处于静止状态的特征,高表达抗凋亡因子和端粒酶mRNA,而标志细胞增生的MCM7基因mRNA表达下调。肺癌的侧群细胞高表达ABCG2、AKRICL/C2、TM4SF1、NROBI基因表达上调并且具备肿瘤干细胞的生物学特征。SP细胞是鉴定肿瘤干细胞的一种简单有效并且廉价的方法。本实验采用流式细胞术和Hoechst33342染色法检测不同浓度莱菔硫烷(1.0和5.0μmol/L)对肺癌细胞内侧群细胞的影响。4.不同浓度的莱菔硫烷处理H460细胞3天后,制备细胞爬片或提取细胞总蛋白,采用免疫荧光和蛋白印迹法检测莱菔硫烷对肺癌多潜能维持因子(Nanog、 OCT4、Sox2和c-Myc)的影响。5.构建Nanog启动子启动的荧光素酶表达载体,用以标记肺癌干细胞；建立裸鼠移植瘤模型；采用腹腔注射法,50mg/Kg,1次／天,在活体动物中实时观察莱菔硫烷对移植瘤中Nanog阳性细胞的荧光素酶活性的影响,1次／3天,间接观察莱菔硫烷对肺癌干细胞自我更新的影响。6.采用蛋白印迹法检测不同浓度莱菔硫烷对Wnt/(3-catenin调控通路的影响；转染S33Y质粒,构建过表达活化型(3-catenin细胞株H460-S33Y,观察莱菔硫烷对H460-S33Y细胞多潜能维持因子Nanog和c-Myc表达的影响；7.采用QPCR和蛋白印迹法检测莱菔硫烷对miRNA的影响,靶向抑制相关miRNA后检测相关蛋白的影响；采用RNA22在线分析程序和启动子分析程序等分析相关：miRNA与相关基因的靶标关系及调控关系。8.采用双荧光素酶报告基因载体验证miRNA与靶基因的关系。结果1.莱菔硫烷能有效抑制肺癌细胞H460和H446,其IC50分别为11.2和9.8μmol/L。莱菔硫烷在高浓度(10μmol/L)下可诱导细胞凋亡(F=36.54.P=0.003)。2.在体外培养条件下,莱菔硫烷呈剂量依赖性地减少肺癌细胞H460和H446细胞的原代肿瘤球体积(H460细胞：F=30.69,P=0.000；H446细胞：F=14.19,P=0.000),抑制其原代肿瘤球形成能力(H460细胞：F=63.67,P=0.000；H446细胞：F=128.32,P=0.000)和二代肿瘤球形成(H460细胞：F=19.46,P=0.000；H446细胞：F=74.44,P=0.000)。莱菔硫烷在较低的浓度下(1.0μmol/L)即可明显抑制肿瘤球的形成,在5.0μmol/L时几乎不能形成肿瘤球。莱菔硫烷抑制肿瘤干细胞的浓度比抑制肿瘤细胞的浓度(IC50为～10μmol/L)低至少10倍,提示莱菔硫烷特异地靶向抑制肿瘤干细胞。原代肿瘤球经消化再次进行肿瘤球培养后,第2代肿瘤球在没有加入药物处理的情况下肿瘤球形成的数量在各组间仍有统计学差异,提示原代肿瘤球经药物处理后肿瘤细胞内的肿瘤干细胞含量显著减少。流式细胞术检测SP细胞时也发现莱菔硫烷在较低浓度下即可减少H460细胞中的SP细胞含量。经不同浓度莱菔硫烷(1.0、5.0和10μmol/L)处理的H460细胞中,经蛋白印迹检测发现肺癌细胞中多潜能维持因子的表达受到明显抑制,呈现剂量依赖性,这提示肺癌干细胞自我更新的活性明显降低。3.成功构建Nanog启动子荧光素酶报告质粒(Nanog-luc)并建立稳定表达Nanog-luc的H460Nanog-luc细胞株；成功应用此细胞株建立肺癌移植瘤动物模型。在此模型中莱菔硫烷有效抑制肺癌细胞H460中荧光素酶活性(F=242.06,,P=0.000),处理组比对照组降低至少76.81%。4.莱菔硫烷处理H460后,P-catenin蛋白的表达受到抑制,呈现剂量依赖性和时间依赖性；成功构建过表达活化的P-catenin细胞株H460-S33Y并且证实在此细胞中(3-catenin表达水平显著高于亲本细胞；莱菔硫烷处理理H460-S33Y细胞后Nanog和c-Myc蛋白表达受到抑制,这提示莱菔硫烷可通过Wnt/p-catenin通路以外的其他途径调控肺癌干细胞自我更新。5.莱菔硫烷处理H460细胞后观测肿瘤干细胞相关的miRNA变化时,发现miR-214的转录水平升高至少8.8倍；抑制miR-214可促进c-Myc和Sox2的表达,而莱菔硫烷与miR-214共同处理肿瘤细胞时c-Myc和Sox2蛋白的表达下调。RNA22程序分析结果表明,miR-214可直接作用于c-Myc mRNA中的编码区序列。启动子序列分析表明,Sox2启动子序列中存在5个c-Myc结合位点。6.成功将c-Myc编码区片段插入psiCHECK-2并构建了c-Myc编码区片段调控的双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶报告载体检测结果表明,miR-214可通过结合c-Myc编码区片段,影响海肾荧光素酶的活性。结论1.莱菔硫烷能在体内和体外条件下有效抑制肺癌细胞中的分化细胞并特异地靶向抑制肿瘤干细胞的自我更新,抑制多潜能因子的表达。2.除了Wnt/β-catenin通路外,莱菔硫烷还可通过其他调控途径抑制肺癌干细胞自我更新。3.首次证实莱菔硫烷经由miR-214途径抑制c-Myc和Sox2表达的表达。4.首次提出并证实miR-214抑制c-Myc蛋白表达的机制是通过直接结合靶基因编码区序列而实现的。5. c-Myc和Sox2之间可能存在调节环路,c-Myc可能通过直接结合Sox2启动子,进而调控Sox2基因的表达。