食源性致病菌引起的疾病是威胁人类健康的重要因素,也是造成人类死亡、财产损失的重要原因。目前,对食源性致病菌的检测主要依靠传统的分离培养和免疫学分析等方法,耗时长、操作繁琐,每次只能确定或排除一种病原体,无法满足公共安全卫生监控、临床诊断、流行病学调查等实际需要。食源性致病菌如痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等仍然是严重威胁人类生命和健康的常见、重要食源性和传染性致病菌。所以,为有效监控食品、生活用水的卫生安全,建立多重、快速、有效的检测技术十分必要。荧光定量PCR (qPCR)技术是1992年由日本人Higuchi第一次提出,真正市场化是美国应用生物系统公司1996年推出的qPCR仪,从而实现了PCR从定性到定量的飞跃。目前应用最为广泛、最具有应用前景的是TaqMan探针法。该技术的基本原理是在扩增时加入两条寡核苷酸短链引物和一条双标记的探针。当探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。随着PCR的进行,当引物延伸至探针位置时,Taq酶发挥其5’→3’外切酶活性,将探针5’端的荧光分子从探针上切割下来,淬灭分子失去对荧光分子的淬灭作用,从而使荧光分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。许多食品基质、培养基、核酸提取试剂都可能会对PCR有抑制作用,导致检测敏感性显著降低,甚至出现假阴性结果。通过改善样品预处理过程来解决这种抑制现象,并通过一些手段对处理后的每一个PCR反应进行评估,来判断抑制是否消除。目前,唯一能够达到这种目的的途径就是在荧光定量PCR反应体系中引入内质控(IAC),并且再加入一条能够与IAC特异结合的标记有另(?)种不同荧光基团的探针,在同一个反应体系中,通过这两个标记有不同荧光染料的探针,就可以既达到定量检测靶序列的目的,又能同时对PCR的效率或抑制现象进行有效评估。本研究拟采用金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌为研究对象,通过生物信息学、分子生物学等方法分析,遴选出各病原菌的特异性基因,建立几个基于TaqMan探针的多重qPCR方法,既能定量检测致病菌特异基因信号,又能同步检测到控制假阴性的IAC信号。通过lambda噬菌体DNA标准物质的制备研究,进行金黄色葡萄球菌,肉毒梭菌,痢疾志贺菌,沙门氏菌等食源性致病菌基因组核酸(gDNA)定量标准物质的制备研究。同时将各病原菌的特异性基因克隆到相应质粒载体中作为其溯源的工作参考物质,然后以该工作参考物质为基础,通过qPCR技术完成微生物量值溯源传递途径的分析,以及模拟样品和实际样品特定微生物量值溯源传递途径的分析、评估。日的：1.通过lambda噬菌体]DNA标准物质候选物的制备研究,进行金黄色葡萄球菌,痢疾志贺菌,沙门氏菌,肉毒梭菌等食源性致病菌gDNA定量标准物质的制备研究。2.利用SmartCycler系统建立一种高敏、特异、简便、快速的qPCR检测金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法,并在LightCycler 2.0, ABI 7300仪器上对所建立的体系进行评估。方法：1.以lambda噬菌体λcI857 Sam7突变株为候选物,研制用于食源性致病菌核酸量值溯源的一级标准物质。2.金葡菌ATCC 6538株、痢疾菌ATCC 51197株、沙门氏菌ATCC 14028、肉毒梭菌A型62A株、B型621株、E型619株为侯选物,研制食源性致病菌核酸定值二级标准物质。3.选择金黄色葡萄球菌,痢疾志贺菌,沙门氏菌,肉毒梭菌等的特异性基因保守区；用Beacon Designer 7.5设计引物和Taqman探针,将筛选出的引物及探针进行Blast比对,确定其特异性,建立检测体系。4.对qPCR反应体系进行优化,确定最佳的引物、探针浓度。5.针对金黄色葡萄球菌,痢疾志贺菌,沙门氏菌,在反应体系中加入内质控IAC,并对IAC浓度进行优化。通过利用另一个标记不同荧光基团的Taqman探针来检测IAC信号,使体系能同时检测IAC与靶基因扩增。6.针对肉毒梭菌A/B/E三型,建立三重qPCR反应,能在一个反应管中同时检测到这三种不同型的肉毒梭菌。7.收集61株近源或食品相关病原菌的标准菌株对体系的特异性进行验证。8.选取上述6种病原菌定量检测靶序列的两端序列,用Primer primer 5.0设计合成引物,扩增含靶序列的片段,连接入pMD18-T载体,构建工作参考物重组质粒,并用EcoRⅠ酶切线性化,用EASY Dilution液稀释制成标准模板溶液,构建工作参考物标准曲线。9.分别以10倍梯度稀释的工作参考物重组质粒、纯化的gDNA,菌落计数菌液10倍梯度稀释液提取的gDNA为模板,对反应体系的灵敏度进行评估。10.用金葡菌ATCC 6538株、痢疾菌ATCC 51197株、沙门氏菌ATCC 14028株污染饮用水和牛奶,用肉毒梭菌A型62A株、B型621株、E型619株污染牛奶来模拟实际样本,采用该体系来检测模拟样本以评价体系的性能。11.选择LightCycler 2.0和ABI 7300等两款荧光定量PCR仪对所建立的体系进行评估验证。结果：1.通过对不同方法提取lambda噬菌体DNA进行比较,最终选取用QIAGEN公司的λDNA提取试剂盒提取纯化得到λDNA标准物质(一级标准物质)。并经酶切鉴定、PCR鉴定以及测序鉴定,最终都表明所提取的DNA为lambda噬菌体突变株λCI857 Sam 7株的DNA。2.通过对两种不同试剂盒提取细菌gDNA进行比较,最终选取用北京TIAGEN生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌gDNA,制备食源性致病菌核酸标准物质(二级标准物质)。3.利用上述61株标准菌株验证本体系特异性,结果仅目的菌的靶基因有特异性扩增,其他细菌均无扩增,即没有扩增信号出现,显示体系是100%特异的。无论目的基因是否有扩增,内质控IAC扩增的JOE荧光均出现阳性信号(针对金葡、痢疾、沙门菌),Ct为33个循环左右。4.建立的工作参考物线性质粒定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2≥0.999),曲线斜率接近于理论值-3.32,由斜率得出的PCR效率E>90%。5.以含靶基因片段的线性质粒作为模板,针对金葡菌、痢疾菌、沙门菌等,反应体系的灵敏度最低可达到2拷贝／反应体系(金葡菌)、10拷贝／反应体系(痢疾菌)、5拷贝／反应体系(沙门菌)；针对肉毒梭菌A/B/E三重PCR,最低分别能检测到5拷贝／反应体系(A型)、2拷贝／反应体系(B型)、5拷贝／反应体系(E型)的线性质粒;以gDNA为模板,最低均能检测到lOfg/反应体系。6.用涂平板法计数并10倍梯度稀释的菌液提取的gDNA为模板,最低能检测到5.0×101 cfu/ml(金葡菌)、2.74×101 cfu/ml(痢疾菌)、1.41×101 cfu/ml(沙门菌),2.11×101 cfu/ml(肉毒A型)、1.02×101 cfu/m(肉毒B型)、5.38×101 cfu/ml(肉毒E型)的细菌细胞。7.针对模拟饮用水样,最低分别能检测到5.0×101 fu/25ml水样(金葡菌)、2.74×101 cfu/25ml水样(痢疾菌)、1.41×101 cfu/25ml水样(沙门菌)的细菌细胞。8.针对模拟牛奶样,最低分别能检测到5.0×102 cfu/25ml牛奶样(金葡菌)、2.74×102 cfu/25ml牛奶样(痢疾菌)、1.41×102 cfu/25ml牛奶样(沙门菌)、2.11×10225cfu/ml牛奶样(肉毒A型)、1.02×102 cfu/25ml牛奶样(肉毒B型)、5.38×102 cfu/25ml牛奶样(肉毒E型)的细菌细胞。9.所建立的qPCR体系,在SmartCycler, LightCycler 2.0、ABI7300等这三款不同厂家、不同型号的仪器上都能得到较好的结果,完全适用于这些不同的荧光定量PCR仪。结论：1.国内首次提出了研究食源性致病菌gDNA的含量测量溯源路线,并对标准物质的制备、定值进行了探索。2.本研究所建立的针对金黄色葡萄球菌,痢疾志贺菌,沙门氏菌的qPCR检测方法,具有IAC,既能定量检测食物传播病原体,又能监测PCR体系以防止假阴性发生或低估病原菌污染量,对食源菌诊断研究领域又是一个补充。3.本研究建立了检测金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌以及肉毒A/B/E的多重、快速qPCR检测技术平台,该技术快速、灵敏、特异,能够适用于不同厂家、不同型号的仪器,在公共安全卫生监控、临床诊断、流行病学调查等方面具广泛的应用前景。