第一部分温度敏感性水凝胶植入对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用背景：急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是冠心病（coronary artery heart disease,CHD）患者死亡的主要原因,严重危害人类健康。早期、充分、持续地开通梗死相关动脉,使缺血心肌及时获得充分灌注是挽救濒临坏死的心肌、缩小梗死范围、防止心室重构、改善临床预后、降低死亡率的关键。溶栓治疗和经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）等再灌注疗法可使梗死相关动脉再通,极大的降低了心源性死亡率,因而广泛应用于临床。大量动物实验和临床证据表明,对缺血心肌血运重建的过程本身会引起额外的心肌损伤,降低了心肌再灌注治疗的获益,该现象被称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。MIRI包括可逆的再灌注性心律失常、心肌抑顿,及不可逆的微循环障碍、致死性心肌再灌注损伤。微循环障碍和致死性再灌注损伤使梗死面积扩大、心室收缩舒张功能降低,进而发生相应的心室重构,导致严重的心力衰竭。因此,减轻心肌缺血再灌注损伤、限制心梗面积扩展、防止心室重构,对于提高急性心肌梗死的治疗效果,改善心梗患者的远期预后,具有重要的临床意义。温度敏感性水凝胶葡聚糖-聚己内酯-甲基丙烯酸羟乙酯共聚N-异丙基丙烯酰胺（Dextran-poly（e-caprolactone）-hydroxylethyl methacrylate/poly（N- isopropy-lacrylamide）,Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm）由教育部武汉大学生物医用高分子材料重点实验室开发,是一类新型高分子材料,具有良好的生物相容性和生物可降解性。其在特定温度的作用下可发生液相一固相转变,进行局部成胶。成胶后的温度敏感性水凝胶,不仅能对局部产生机械支撑的作用,同时具有与细胞外基质类似的三维多孔网状结构,利于氧气、营养物质、代谢产物的运输和交换,适合细胞生长、便于携带生物活性物质,为细胞提供了良好的微环境。本实验将该水凝胶注射到大鼠心肌缺血再灌注后的缺血周边区,观察其疗效并探讨其可能机制。目的：本实验的目的旨在探究直接心肌内注射温度敏感性水凝胶Dex-PCL-HEMA/ PNIPAAm对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡、心室重构以及心脏功能恢复的作用情况,并探讨其可能的作用机制。方法：将25只体重在200g到250g范围的雄性SD大鼠分为3组。开胸后结扎大鼠冠状动脉左前降支30min后放松结扎线,制作大鼠心肌缺血再灌注模型。以仅穿线但不结扎冠状动脉者为假手术组（Sham组）,将心肌缺血再灌注模型制作成功的大鼠随机分为2组,分别经心肌于心肌缺血周边区多点注射下列物质：100μl磷酸盐缓冲液（PBS组）；100μ1温度敏感性水凝胶Dex-PCL-HEMA/ PNIPAAm（Gel组）。注射后28天,进行超声心动图检测左室舒张末内径（left ventricular end diastolic dimension,LVEDD）,左室收缩末内径（left ventricular end systolic dimension,LVESD）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）,评价心功能；TUNEL染色分析心肌细胞凋亡情况；Masson三色染色检测心梗面积,评价心室重构。结果：超声心动图检测结果显示：与PBS组相比,Gel组LVEDD及LVESD显著下降,LVEF显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。TUNEL染色结果显示：Gel组的心肌凋亡指数明显低于PBS组,差异有统计学意义（P<0.05）。Masson三色染色结果显示：相较于PBS组,Gel组心肌梗死面积明显减少、梗死区室壁厚度明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：温度敏感性水凝胶Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm直接心肌内注射至大鼠心肌缺血再灌注后的缺血周边区可通过抑制心肌细胞凋亡、降低心梗面积、抑制心室重构从而改善心脏功能。其机制可能与水凝胶为心肌细胞提供了良好的微环境及结构支持有关。第二部分温度敏感性水凝胶携带ACE-shRNA质粒对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用背景：心肌缺血再灌注过程中肾素—血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）的激活在心肌梗死后的心室重构中发挥着重要作用。肾素使血管紧张素原形成没有活性的血管紧张素Ⅰ（angiotensin Ⅰ,Ang Ⅰ）,Ang Ⅰ在内皮血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme, ACE）的作用下转换成具有生物活性的血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）。Ang Ⅱ在众多血管紧张素家族成员中作用最为重要,过度激活与心肌梗死后心脏组织修复及重构有关。因此,应用血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI）抑制Ang Ⅰ向Ang Ⅱ转换,调控RAS系统特别是Ang Ⅱ的水平,必然在心肌梗死后心室重构的治疗及预防中发挥重要作用。已有众多研究证实ACEI在冠心病心肌缺血再灌注动物模型中的治疗作用,且ACEI也被广泛应用于临床冠心病心肌梗死患者的药物治疗中。然而ACEI因其引起刺激性干咳及降低血压等副作用,以及治疗剂量的选择等众多问题使其在临床心血管疾病中的应用受到限制。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是一种通过内源或外源性双链RNA （double-stranded RNA,dsRNA）介导,特异性降解相应序列的信使RNA（messenger RNA,mRNA）,导致靶基因表达沉默,产生相应功能缺失的新型基因沉默技术。通过RNA干扰技术介导血管紧张素转换酶基因沉默,可能是实现比ACEI优越的心脏保护作用、规避ACEI不良反应的一个更好的选择。目前在体内诱导RNA干扰主要通过化学合成的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）片段进入细胞并识别特异mRNA后发挥作用,但体外合成的小干扰RNA片段进入体内易被降解,作用时间不稳定。以质粒DNA（plasmid DNA,pDNA）载体及脂质体/DNA复合物为代表的非病毒载体相较于病毒载体具有安全、无基因插入片段大小限制以及使用简单、制备方便、便于保存及检验等优势,然而其转染效率较低、靶基因的沉默效应持续较短等特点都极大的了限制了其应用。因此,寻找高效、稳定、方便构建的表达载体是RNA干扰技术应用的关键。温度敏感性水凝胶Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm具有性质易调整、良好的生物相容性、局部缓释和靶组织浓度高的特点,可增加小干扰RNA片段的作用时间,从而增加转录后基因沉默效应。本研究在第一部分证明了温度敏感性水凝胶本身对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用基础上,进一步探讨以该水凝胶为载体,利用RNA干扰技术对血管紧张素转化酶进行基因沉默,能否实现更为优越的心脏保护作用。目的：本实验的目的旨在探究温度敏感性水凝胶Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm作为载体携带ACE-shRNA质粒注射入大鼠心肌缺血再灌注后的缺血周边区能否延长外源基因表达时间以及增强基因表达效果,从而降低大鼠心脏局部ACE的表达。此外,能否获得比单独注射ACE-shRNA质粒或单独注射水凝胶获得更优越的心脏保护作用。方法：选取60只体重在200g到250g范围的雄性SD大鼠为实验对象。开胸后结扎大鼠冠状动脉左前降支30min后放松结扎线,制作大鼠心肌缺血再灌注模型。将心肌缺血再灌注模型制作成功的大鼠随机分为4组,分别经心肌于心肌缺血周边区多点注射下列物质：100μl磷酸盐缓冲液（PBS组）；100μl含有10μlACE-shRNA质粒的磷酸盐缓冲液（pDNA组）；100μl含有10μl阴性ACE-shRNA质粒的温度敏感性水凝胶（NC组）；100μl含有10μl ACE-shRNA质粒的温度敏感性水凝胶（pDNA+Gel组）。注射后28天,通过荧光显微镜观察冰冻切片中增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达情况、实时定量RT-PCR检测ACE mRNA水平、Western blotting检测ACE蛋白水平；并进行超声心动图检测左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）,评价心脏功能；TUNEL染色检测心肌细胞凋亡；Masson三色染色检测心梗面积,评价心室重构。结果：治疗28d后,pDNA+Gel组可检测到增强绿色荧光蛋白表达,而pDNA组未检测到。与PBS组相比,NC组LVEF显著增加、LVEDD与LVESD显著减少、细胞凋亡与心肌梗死面积显著减少、心肌ACE表达明显降低（P<0.05）。而pDNA+Gel组在上述指标上进一步加强了这种心脏保护作用（P<0.05）。pDNA组与PBS组在上述指标上无显著差异。结论：温度敏感性水凝胶Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm携带ACE-shRNA质粒直接注射至大鼠心脏后可延长外源基因的表达时间和增强基因的表达效果。此外,在大鼠心肌缺血再灌注后,温度敏感性水凝胶Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm携带ACE-shRNA质粒直接心肌内注射能降低心脏局部ACE的表达,并比单独注射ACE-shRNA质粒或水凝胶取得了更为优越的心脏保护作用。