论文部分内容阅读
目的：缝隙连接（gap junction，GJ）通道可调节相邻细胞间代谢分子和离子的通透，因此在疾病的发生发展中起着重要作用。GJ通道的启闭可通过膜电压，细胞内微环境，蛋白间相互作用，磷酸化来调节。不同连接蛋白组成的缝隙连接通道有特异的电导率和通透率。前期研究表明在蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)中缝隙连接通道发生了重构，尤其以Cx43表达升高，Cx40表达下降最为明显，伴有Cx37, Cx45轻度升高。本实验拟建立理想的真核表达载体，在缺乏缝隙连接通讯的HeLa细胞系上表达连接蛋白Cx37、Cx40、Cx43、Cx45并形成稳定转染细胞株，不仅为进一步探讨重构后同型、异型缝隙连接通道的物质选择性和通透性等变化及影响因素提供有效的细胞模型，而且在体外为基于缝隙连接蛋白相关信号通路为靶点的药物机制研究提供平台。方法：1.采用RT-PCR技术从人肾上皮293T细胞、脐静脉内皮细胞总RNA中扩增Cx40，Cx37ORF全序列基因，Cx45ORF全序列基因从载体M51中扩增。测序鉴定后，运用质粒酶切、连接及转化等方法构建缝隙连接蛋白Cx37,Cx40,Cx45真核表达重组质粒phCx37-IRES2-EGFP，phCx40-IRES2-EGFP。2.从单克隆菌落中制备转染级别重组质粒phCx37-IRES2-EGFP、phCx40-IRES2-EGFP、phCx43-IRES2-DsRed、phCx45-IRES2-EGFP，分别运用脂质体lipofectamine2000和非脂质体FuGENE HD转染试剂对HeLa细胞行重组质粒转染实验。转染48小时后，瞬转细胞组行RT-PCR和Western blot检测。稳转组转种至24孔板，二十四小时后进行800ug/ml G418加压筛选。两周后，阴性细胞死亡，挑取阳性克隆转种至96孔板继续加压筛选，5-6周后形成稳定转染细胞株并扩大培养。3.运用RT-PCR及weston-blot技术检测各稳定转染细胞株连接蛋白基因和蛋白的表达鉴定。结果:1.构建Cx37、Cx40，Cx45基因的真核表达载体phCx37-IRES2-EGFP，phCx40-IRES2-EGFP，phCx45-IRES2-EGFP，通过RT-PCR、Western blot方法从转录和翻译水平都检测到了目标基因的表达产物。2.筛选出带有Cx37，Cx40，Cx43和Cx45稳转HeLa细胞株。结论：成功扩增出缝隙连接蛋白Cx37，Cx40基因全长ORF序列，构建了含Cx37，Cx40，Cx45基因的真核表达载体phCx37-IRES2-EGFP、phCx40-IRES2-EGFP、phCx45-IRES2-EGFP。在缺乏缝隙连接通讯的HeLa细胞上建立了广泛表达于心脑血管系统中的缝隙连接通道，这为进一步研究同型、异型缝隙连接通道选择通透性的变化及其影响因素和在体外模拟蛛网膜下腔出血后缝隙连接通道的类型变化提供实验平台。