月季组蛋白去甲基化酶RcJMJ12和RcJMJ36在花器官发育中的功能解析

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‘绿萼’是中国古老月季最重要的种质资源之一,具有特异的花器官表型,表现为花瓣、雄蕊、雌蕊萼片状,而其恢复材料的花器官表型在适温及高温之间会发生转变,是研究月季花发育机制的极好材料。本研究以‘绿萼’及其恢复材料为试验材料,以花器官发育正常的‘月月粉’作为对照,通过花粉培养和自交试验,对其花器官表型和育性进行鉴定;通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)测序方法,对H3K27me3组蛋白(组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰)在高温时的‘绿萼’及其恢复材料花器官中的相关调控基因进行分析;利用RT-q PCR技术对组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12、Rc JMJ36基因及高温响应因子HSFA2在高温处理不同时间及不同组织部位的‘绿萼’及其恢复材料中的表达进行分析;进一步构建病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体并侵染‘月月粉’,对沉默植株进行表型鉴定及RT-q PCR分析,初步探索组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36基因在月季花器官发育中的功能。主要研究结果如下:1.采用花粉液体培养及自花授粉的方法,分析了‘绿萼’恢复材料的花器官表型和花粉育性。结果表明,‘绿萼’恢复材料在适温下(20-25℃)表型与‘月月粉’基本一致,花瓣、雌蕊及雄蕊发育正常;其花粉萌发率和结果率分别为23.99%和35.00%,育性基本恢复。2.利用染色质免疫共沉淀技术,以H3K27me3为目的蛋白,进行了Ch IP测序。结果表明,样本数据的比对效率和unique read比例均达到85.00%左右,在‘绿萼’中富集到的Peaks数量高于其恢复材料,但二者Peaks长度差异不大;富集到的Peaks主要分布于基因间区,且Peaks相关基因主要位于启动子转录起始位点的下游;H3K27me3组蛋白修饰过程基因参与的功能在‘绿萼’及其恢复材料中不完全相同,‘绿萼’恢复材料中被H3K27me3修饰的基因参与生物过程和细胞组分的更多,参与分子功能的较少;在‘绿萼’及其恢复材料中共有8条相同的KEGG信号通路;在Peaks可能的motif中高温响应因子HSFA2的富集明显且有较高相关性。3.利用荧光定量PCR技术,首先对不同高温处理时长的‘绿萼’及其恢复材料中Rc JMJ12、Rc JMJ36和HSFA2基因的表达进行分析,结果表明:‘绿萼’及其恢复材料在经过高温(30℃)处理后,其嫩芽中的Rc JMJ12、Rc JMJ36和HSFA2表达水平均呈下降趋势。然后,以‘绿萼’为对照,分析了Rc JMJ12、Rc JMJ36及HSFA2三个基因在适温(20℃)和高温(30℃)下的‘绿萼’恢复材料中的表达情况。结果表明:三个基因在高温处理下‘绿萼’恢复材料花器官中的表达水平与‘绿萼’基本一致。4.分别构建组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36的VIGS载体,用‘月月粉’进行侵染,通过嫁接得到沉默植株后进行荧光定量PCR检测和表型鉴定。结果表明,30个嫁接芽共有17个成活,成活率约为56.67%;获得由p TVR2-Rc JMJ12和p TVR2-Rc JMJ36沉默植株共8株,侵染效率为47.10%;在沉默植株中组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36的基因表达水平显著下降,且与对照植株相比,沉默植株的花瓣、雌蕊及雄蕊数量增多。研究结果不仅为揭示月季组蛋白去甲基化酶Rc JMJ12和Rc JMJ36基因在‘绿萼’花器官发育中的功能提供理论依据,而且为月季花器官萼片化发育的分子机制提供新思路,同时也为独特花型的月季新品种选育奠定了基础。
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