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当前,无论是高等哺乳动物还是低等水生无脊椎动物,基因功能的深入研究均离不开相应的体外细胞培养。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)作为一种典型的甲壳动物,其体外细胞培养技术非常薄弱,影响了其基因功能研究。本文筛选和优化了中华绒螯蟹血细胞的体外培养方法和条件,然后以雷帕霉素靶蛋白(Metazoan target of rapamycin,mTOR)为重点分析对象,研究了该基因在中华绒螯蟹活体和培养血细胞中的表达差异和对RNA干扰的响应效应,探讨了培养血细胞用于中华绒螯蟹相关基因功能研究的可行性,分析了mTOR基因在中华绒螯蟹蜕壳与生长方面的生物学功能。论文的具体研究结果如下:一、中华绒螯蟹血细胞体外培养及管家基因检测为探索中华绒螯蟹血细胞原代培养所需的适宜培养基和关键培养条件,为后续的基因功能研究提供基础。本章分析了5种培养基(1×L-15、2×L-15、3×L-15、Sf-900和TC-100培养基)、5个渗透压条件(原渗透压、569、803、991和1215 m Osm/kg)和5个血清浓度(0%、5%、10%、15%和20%)对中华绒螯蟹血细胞的体外培养效果,并检测了培养细胞的基因表达情况。结果发现:TC-100培养基培养的中华绒螯蟹血细胞形态最佳,存活率最高;以TC-100培养基为基础培养基,筛选出渗透压为991 m Osm/kg和不添加胎牛血清(0%)时培养的细胞形态更好,培养至10 d天的成活率仍在50%以上;3个管家基因(β-actin、S27和UBE)在血细胞培养过程中(0-10 d)均稳定表达。结果表明,本研究筛选的培养基及关键培养条件能更好的培养中华绒螯蟹血细胞,培养的细胞能进行初步的基因功能实验。本研究为中华绒螯蟹为mTOR基因功能研究提供了新的技术手段。二、中华绒螯蟹mTOR基因的克隆与组织、培养血细胞的表达分析为了进一步验证培养血细胞进行基因功能表达研究的可行性和探究mTOR基因在中华绒螯蟹蜕壳与生长过程中的潜在功能,本章首先对中华绒螯蟹mTOR基因进行克隆,并通过RT-PCR对mTOR基因在四个蜕壳时期(蜕壳前期、蜕壳期、蜕壳后期、蜕壳间期)的12个不同组织(眼柄、肝胰腺、心脏、鳃、胃、肠、步足肌肉、鳌足肌肉、胸部肌肉、胸神经节、表皮和血液)的时空表达进行分析,最后通过RT-PCR对培养血细胞与活体血液中mTOR基因的时空表达作了进一步比较。研究发现,中华绒螯蟹mTOR基因的ORF长度为7026 bp,5′端非编码区(5’-UTR)为1449 bp和3′端非编码区(3’-UTR)为1667 bp,编码2342个氨基酸;mTOR基因在4个蜕壳时期的各个组织中均有表达,其中在肝胰腺、肠、胸神经节和血液中的表达量较高;在蜕壳间期的步足肌肉、鳌足肌肉和胸部肌肉的表达量明显高于其他蜕壳时期,而蜕壳期表达量最低,表明mTOR基因在肌肉处于萎缩状态的蜕壳前期和蜕壳期的表达量低,而在肌肉生长和代谢旺盛的蜕壳间期和后期的表达量高。mTOR是肌肉生长的正向调控因子,在中华绒螯蟹蜕壳与生长过程发挥作用。对培养血细胞与活体血液中mTOR基因时空表达分析表明,培养血细胞中的mTOR基因表达与活体组织血液中的表达基本一致,表明体外培养血细胞可以用于中华绒螯蟹的基因功能研究。三、mTOR基因在活体与培养血细胞的RNA干扰效果研究为比较活体与培养细胞对RNA干扰的响应效应,探究mTOR基因在中华绒螯蟹蜕壳与生长中的作用,本章利用RNAi技术对中华绒螯蟹在一个蜕壳周期的mTOR基因进行敲降实验,并对干扰后的肌肉与肝胰腺组织中的生长相关基因(P38,IGF2)、蜕壳相关基因(ECR,RXR,MIH)以及脂质代谢相关基因(LP,CPT,FABP3)的表达进行分析。发现敲降mTOR基因后,河蟹的蜕壳时间显著延长(P<0.05),特定生长率显著降低(P<0.05),存活率和肝胰腺指数有所下降,但差异不显著(P>0.05);敲降后河蟹肌肉和肝胰腺组织中的蜕壳相关基因(ECR和RXR)表达量有所降低(P>0.05),其中MIH基因表达下降显著(P<0.05);生长相关基因(P38和IGF2)的表达量显著降低;步足肌肉中的三个脂质代谢相关基因的表达量显著上升(P<0.05)。干扰mTOR基因后,培养血细胞的存活率明显低于干扰血细胞。