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目的1.构建针对乙型肝炎病毒X基因的siRNA表达载体;2.将构建成功的siRNA表达载体与miR-16真核表达载体pmiR-16进行重组,形成一个带双启动子双目的基因的表达载体pHsa-miR16-shRNA;3.将重组质粒在人肝癌细胞系中转录,通过现代分子生物学技术鉴定其生物活性。4.利用该重组质粒初步探讨miRNA、siRNA与乙型肝炎病毒复制之间的关系。方法1.设计并合成一对60nt的编码siRNA寡核苷酸链,退火、磷酸化后形成双链DNA,克隆到pSUPER质粒的BglII和XhoI两个酶切位点之间,转化筛选得到稳定的克隆,命名为siR-1583。2.设计一对引物5’-CGGGATCCATTCGAACGCTGACGT-3’( sence )和5’-CGGAATTCAAAAAGCACTTCGCTTCACC-3’( antisence ),从重组质粒siR-1583中扩增含有H1启动子及HBV X siRNA的DNA片段,PCR产物插入到重组质粒pmiR-16的BamHI和EcoRI两个酶切位点之间,形成一个携带两个独立表达框的双表达载体。转化筛选得到稳定的克隆,命名为pHsa-miR16-shRNA。3.将重组质粒pHsa-miR16-shRNA转染稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞,对细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,荧光定量PCR分别检测mRNA和HBV DNA的抑制效果。结果1.构建载体: siR-1583经双酶切鉴定,能够获得预期大小的目的片段; pHsa-miR16-shRNA经PCR、双酶切鉴定,可获得预期大小片段; pHsa-miR16-shRNA经Invitrogen公司测序证实,siR-1583的编码基因片段已经正确插入pmiR-16载体中。2.载体的功能鉴定及应用: Elisa、RT-PCR、荧光定量PCR的结果均表明:成功构建的能同时表达人miR-16和针对HBV X基因的shRNA双表达载体pHsa-miR16-shRNA,其相对单表达载体能更明显地抑制HepG2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,荧光定量PCR结果也证实了其抑制作用的优势。结论1.针对乙型肝炎病毒X基因的siRNA序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上;2.成功构建了能同时表达人miR-16和针对HBV X基因的siRNA双表达载体pHsa-miR16-shRNA;3.在对pHsa-miR16-shRNA与HBV复制关系的初步探索中,我们的实验结果说明双表达载体表达的siRNA和miRNA分子对乙型肝炎病毒复制的影响具有协同作用。pHsa-miR16-siRNA的成功构建,为进一步研究miRNA、siRNA在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用奠定了实验基础。