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背景全身系统性疾病或口颌系统疾病导致的牙周骨组织缺损再修复,是困扰患者更是口腔医生的难题,同时在骨质疏松患者中表现尤为明显。随着社会“老龄化”程度的加重,许多由衰老导致的慢性疾病困扰人们的生活与健康。其中妇女绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO),是骨质疏松症中患病人群最多的一类骨代谢性疾病。据研究报道,此类患者牙槽骨同时具有骨密度减低、渐进性骨破坏以及牙槽嵴高度丧失的病理性改变,使得其牙周骨缺损修复更是难上加难。可见,进一步了解骨质疏松症的病因并且探索骨质疏松条件下的牙周骨缺损修复的治疗途径具有重要的临床意义。随着对骨质疏松症病因的不断深入了解,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)被证实在骨质疏松症宿主体内通过影响骨组织与脂肪组织的改建与形成参与了骨质疏松的发病机制。但是作为干细胞在局部发挥成骨替代效应的前提,骨质疏松症患者体内BMSCs的“归巢”问题应被引起关注。目前尚未有研究对BMSCs的迁移与归巢能力是否具有病理性缺陷做出报道。已被证实的参与细胞迁移及归巢的分子中,基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1α)及其受体CXCR4是研究最为广泛且重要的因子。SDF-1α通过与其受体CXCR4结合可以调控BMSCs的趋化迁移能力,但是尚未有研究对骨质疏松症的BMSCs与此生物轴的相关生物学作用进行探讨。大量研究证明利用外源性BMSCs的自我增殖以及骨向分化能力治疗慢性骨疾病或修复骨缺损是有效的方法。其中BMSCs的移植方法主要分为系统性移植以及局部移植。局部移植BMSCs是进行牙周骨再生常用的组织工程策略,但是具有对移植环境及缓释材料生物性能要求高、植入的细胞数量不稳定、归巢至损伤部位数量较少等缺点。系统性移植BMSCs是骨质疏松全身性治疗的有效方法,其优点是干细胞在宿主体内微环境的影响下更易随着血循环进入损伤部位,缺点是有报道认为移植的细胞会被大量堆积在肝脏及肺部等。但是目前鲜有研究对系统性移植BMSCs治疗骨质疏松牙周骨缺损做出报道。本研究首次将全身治疗骨质疏松疾病系统性移植BMSCs的方法与牙周骨缺损的治疗相结合,主要对SDF-1α/CXCR4生物轴诱导下系统性移植BMSCs修复牙槽骨损伤的募集作用进行评估,希望通过局部SDF-1α的诱导作用促进外源性BMSCs甚至内源性BMSCs的归巢来促进骨质疏松牙槽骨缺损部位的再生修复。目的本研究体外实验首先建立大鼠骨质疏松模型,分离培养骨质疏松与正常大鼠的骨髓间充质干细胞,体外比较两种细胞的一般生物学特性以及与SDF-1α/CXCR4轴相关的生物学特性,探讨此生物轴对去势大鼠BMSCs趋化能力的影响及相关分子机制。为骨质疏松疾病对内源性BMSCs的病理性影响提供理论依据。体内实验建立骨质疏松大鼠牙槽骨缺损模型后,将体外培养扩增的同种正常BMSCs系统移植入大鼠体内,同时在缺损局部将SDF-1α与缓释材料复合后植入缺损部位,评价系统移植BMSCs的局部归巢以及成骨分化效果。为骨质疏松患者的牙周骨缺损及再生修复提供新的治疗途径及依据。方法1.建立绝经后大鼠骨质疏松模型,并用Micro-CT以及力学方法进行模型验证。分离培养来自正常大鼠(Sham组)与骨质疏松大鼠(OVX组)的BMSCs,对二者的一般生物学特性,包括克隆形成能力、增殖能力、免疫分子表型、以及成骨与成脂分化能力进行鉴定与对比。2.通过流式细胞仪鉴定法、免疫荧光染色法、q RT-PCR、Western-Blot对上述两组细胞表面及细胞内的CXCR4表达进行鉴定。通过Transwell实验对两组BMSCs在SDF-1α的诱导下趋化迁移能力进行对比;通过Western-Blot进一步对比两组BMSCs在SDF-1α诱导下迁移相关通路AKT以及ERK的磷酸化水平。3.慢病毒转染法上调OVX-BMSCs的CXCR4表达,通过q RT-PCR、Western-Blot法对上调结果进行验证;Transwell实验进一步验证上调组细胞迁移能力的变化。4.用SDF-1α局部诱导系统移植的BMSCs来修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损。建立大鼠牙槽骨缺损模型后,局部植入SDF-1α复合水凝胶缓释材料,同时系统性移植体外标记CM-Dil的同种异体BMSCs。4周后,通过Micro-CT扫描和三维重建技术对缺损部位的骨再生进行评价;利用HE及马松染色观察微观骨形成;利用免疫荧光技术观察BMSCs在牙槽骨缺损部位的归巢及分化为成骨基因阳性细胞的情况。进一步利用组织PCR技术检测新生骨区域的相关成骨标志性基因以及CXCR4的表达。结果1.(1)经Micro-CT及力学检测,OVX组比Sham组大鼠股骨的骨组织密度(BMD)、骨矿含量(BMC)、骨小梁比值(BV/TV)以及力学数据最大载荷量(Max Load)都大,证明骨质疏松动物模型建立成功。(2)比较Sham-BMSCs与OVX-BMSCs一般生物学特性后结果显示:两者细胞在细胞形态、培养过程、克隆形成率方面没有明显差异,但OVX-BMSCs较Sham-BMSCs的增殖能力稍强。多向分化能力鉴定结果显示:OVX-BMSCS较Sham-BMSCs的成骨分化能力减弱,成脂能力增强。2.(1)比较Sham-BMSCs与OVX-BMSCs的CXCR4表达结果显示:CXCR4受体在两组细胞均为胞核高表达、包膜低表达,OVX-BMSCs较Sham-BMSCs低;并且随着体外培养代数的增加,两组细胞的CXCR4表达均减弱。(2)比较Sham-BMSCs与OVX-BMSCs趋化迁移能力后结果显示:两者细胞都在SDF-1α为100ng/ml时的迁移数量最多;相同SDF-1α浓度下OVX组的迁移能力低于Sham组;CXCR4受体阻断剂AMD3100可明显降低两种细胞的迁移速率,说明CXCR4与OVX-BMSCs的迁移密切相关。(3)比较Sham-BMSCs与OVX-BMSCs在SDF-1α诱导下AKT与ERK通路的磷酸化水平。AKT结果显示:Sham组在30min时磷酸化水平显著上升达到最大值,60分钟时开始下降;而OVX组则在30-60min之间,甚至60min时出现磷酸化水平的最高点。ERK结果显示:Sham组也在30min时ERK磷酸化水平明显升高,60min时稍降低,120min时较60min没有明显变化;而OVX组在60min时磷酸化水平明显增高,120min与60min时不具明显差异。相同时间点比较时发现,加抑制剂组比未加抑制剂组的AKT及ERK磷酸化水平明显降低,并且在不同时间点时的磷酸化与上述不加抑制剂组趋势相似。以上说明OVX组的AKT与ERK磷酸化水平及敏感度较Sham组减弱,并且这一过程与CXCR4的表达密切相关。3.上调OVX-BMSCs的CXCR4表达后迁移能力检测:荧光显微镜下观察EGFP转染BMSCs阳性率大于80%以上,q RT-PCR与Western blot证明上调组BMSCs的CXCR4m RNA及蛋白水平明显升高。趋化迁移实验结果显示CXCR4-OVX-BMSCs体外迁移能力明显升高。4.(1)体内实验结果显示:移植手术4周后用Micro-CT对新生骨组织进行CT值分析以及BMD分析,结果显示系统性移植组(im-BMSCs)组比空白对照组骨再生情况较佳;局部诱导组(SDF-1α+im-BMSCs)骨再生情况明显优于im-BMSCs及空白对照组。(2)HE染色及马松三色染色结果显示:SDF-1α+im-BMSCs组新骨内有更多的富含胶原的新骨及成骨细胞,而单纯im-BMSCs与空白对照组的纤维结缔组织较多。(3)免疫荧光染色结果显示:SDF-1α+im-BMSCs组较im-BMSCs组与空白对照组局部归巢的细胞明显增多,且SDF-1α+im-BMSCs组归巢至局部的细胞表达成骨基因Runx2及OCN的阳性表达增多,说明更多的BMSCs发生了成骨分化。(4)组织PCR结果显示,SDF-1α+im-BMSCs较空白对照及im-BMSCs组Runx2及OCN的表达升高,并且CXCR4的表达也升高显著,提示SDF-1α+im-BMSCs组牙槽骨缺损再生的新骨组织募集了大量的CXCR4阳性表达的细胞。结论1.OVX-BMSCs较Sham-BMSCs的增殖能力增强,成骨能力减弱,成脂能力增强。SDF-1α诱导后OVX-BMSCs较Sham-BMSCs的体外迁移能力较弱,与其CXCR4的表达降低有关。上调OVX-BMSCs表面的CXCR4基因,可以增强其体外迁移能力。2.局部植入SDF-1α缓释水凝胶可以增加系统性移植BMSCs向骨质疏松大鼠牙槽骨缺损归巢的数量,并且通过成骨分化后参与局部骨组织的修复与再生;局部SDF-1α的移植也可能引起内源性BMSCs的归巢。