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由黄曲霉和寄生曲霉等霉菌产生的次级代谢产物黄曲霉毒素,具有高度致畸、致癌和致突变的特性,通过侵染大米、花生等农作物,对人类和动物健康造成了严重的威胁。近年来研究发现生物酶法降解黄曲霉毒素具有高效特异性,不会对环境造成污染。实验室前期已克隆了云芝（Trametes versicolor）的部分基因,命名为黄曲霉毒素降解酶基因（TV-AFB1D）,并表达了能够降解AFB1的TV-AFB1D酶。在此基础上,本研究对TV-AFB1D酶进行了定点突变并将其与AFB1进行分子对接研究,辅助理解活性中心与AFB1的作用机制,获得了酶活性和稳定性提高的TV-AFB1D突变体;构建了枯草芽孢杆菌p HCMC04-TV-AFB1D表达载体,探究了TV-AFB1D酶在十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）改性的蒙脱土K-10（MMT）中的固定化应用;设计了两种TV-AFB1D表达框架利用CRISPR-Cas9技术整合到酿酒酵母基因组中,将基因工程酿酒酵母应用于霉变大米的原位脱毒实验探究效果。主要结论如下:（1）TV-AFB1D突变体的构建及活性研究。利用生物信息学技术,以二肽基肽酶Ⅲ（PDB ID:5yfb.1A）为模板构建TV-AFB1D的同源模型,模型可靠性为73.88%。三维图谱显示TV-AFB1D的活性中心由锌离子与H440、H435和E493配位组成,选择距离小于5?的突变位点Y305,E436和H554将其突变为丙氨酸获得七个突变体。其中H554A、Y305A/H554A、E436A/H554A和Y305A/E436A/H554A突变体的去折叠自由能分别为-4.83、-4.05、-8.69和-8.88kcal/mol。将其与AFB1进行分子对接,探究突变体与AFB1的相互作用模式。研究得出,TV-AFB1D和AFB1对接中主要的作用力为氢键和疏水相互作用力,其中E436A/H554A突变体305位置的酪氨酸苯环与AFB1苯环之间形成π-π相互作用力。四种突变体在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了77 k Da的蛋白,TV-AFB1D突变体的最适温度和p H值分别为32℃和7。H554A、Y305A/H554A、E436A/H554A和Y305A/E436A/H554A突变体的比酶活性在最适条件下分别为22 U/mg、23.9 U/mg、36 U/mg和28.6 U/mg,野生型TV-AFB1D比活为19.6 U/mg。在这四个突变体中,E436A/H554A突变体比活最高。本研究初步探究了TV-AFB1D酶降解AFB1的机制。（2）TV-AFB1D在枯草芽孢杆菌168中的表达及固定化研究。设计了带有SpeⅠ和Bam HⅠ酶切位点的引物用以扩增p ET-28a（+）-TV-AFB1D重组载体中的TV-AFB1D基因,将其导入p HCMC04质粒中构建了p HCMC04-TV-AFB1D重组载体,并将其整合到枯草芽孢杆菌168基因组中,表达了77 k Da的TV-AFB1D酶。通过CTAB对MMT进行了改性并对改性前后及固定化前后的结构变化进行了表征。MMT-CTAB的FTIR光谱显示2928 cm-1、2852 cm-1和1474cm-1处出现CTAB特征峰分别为C-H键的不对称拉伸、对称拉伸振动的峰和C-N拉伸振动,这表明CTAB成功修饰了MMT。在MMT-CTAB-AFB1D光谱中1715 cm-1处出现的峰与羰基C=O的弯曲振动对应,表明MMT-CTAB表面被戊二醛修饰,TV-AFB1D被成功固定到MMT-CTAB中。此外研究了戊二醛浓度对MMT-CTAB固定化效率、TV-AFB1D酶活性及AFB1的降解效果的影响。结果表明,在3%（V/V）戊二醛交联的条件下,MMT-CTAB固定TV-AFB1D的效率达到92.36%,固定化TV-AFB1D的酶活性达到5.48 U/mg,AFB1的降解效率为97.76%。经改性蒙脱土固定化后的TV-AFB1D酶降解AFB1的效率明显提升,更有益于工业应用。（3）TV-AFB1D表达框的构建及基因工程酵母原位脱毒研究。利用CRISPR-Cas9基因敲除技术,将组成型Ca MV（包含Ca MV 35s启动子序列,TV-AFB1D基因和Ca MV poly A信号肽序列）和诱导型AOX1（AOX1启动子序列,TV-AFB1D基因和AOX1终止子序列）表达框架以敲除HXK2基因的方式整合到酿酒酵母基因组DNA中,构建了两种工程酿酒酵母菌株。研究结果表明将表达框整合到HXK2位置中对工程酿酒酵母的生长、葡萄糖消耗和乙醇产生影响较低。AOX1和Ca MV工程菌与野生型酿酒酵母的生长曲线保持一致,发酵24 h,OD600分别为2.14,2.10和2.11。AOX1和Ca MV工程酿酒酵母最高的乙醇产量为8.35和8.43 g/L,为野生型菌株（8.57 g/L）的97.4%和98.4%。起始浓度为20 g/L的葡萄糖均在48 h内消耗完全。发酵液中AFB1的初始浓度为7.4μg/g,发酵24 h后,野生型,AOX1和Ca MV工程酿酒酵母的AFB1含量分别降为6.1,3.4和2.9μg/g,降解效率分别为18%,54%和61%。本研究为AFB1污染大米的原位降解和乙醇生产提供了一种有效策略。