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背景与目的大肠癌（Colorectal carcinoma）是消化系统常见的恶性肿瘤之一，发病率在全球常见恶性肿瘤中居第四位，在我国恶性肿瘤发病率中居第四位。大肠癌是涉及许多相关基因的多因素多阶段的恶性肿瘤，研究发现不仅取决于核内遗传物质，而且还与核外的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）关系密切。mtDNA是细胞内唯一的核外遗传物质，具有可自主复制的DNA基因组。大肠癌细胞的mtDNA改变，国内未见有文献报告，国外虽有文献报告，但却意见不一，不尽相同。Savre—Train等在结肠癌细胞系Caco中检测到2583bp大片段的缺失，缺失为1％，而未检测到基因突变及线粒体基因组不稳定性（mitochondrial genomic instability，mtGI）。Heerdt等研究发现，在结肠癌细胞mtDNA的D-loop区存在基因组的多态性，而未发现mtDNA的突变及mtGI。而在Habano对45例结肠癌和正常组织的mtDNA的研究中，发现有7／45（16％）存在突变，包括3例编码ND1和ND5的移码突变，2例错义突变，15bp的缺失，而没有大片段的缺失，并且进一步研究发现其中22例mtDNA的D-loop区存在（CA）n不稳定及多聚C不稳定，并且认为其与线粒体基因组的错配修复系统有关。与核基因的错配修复系统一样，上述mtDNA基因组不稳定的存在跟肿瘤的发生有密切的关系。人类的线粒体基因组DNA全长也仅仅16Kb，而且序列早已完全清楚，只要通过设计适当的引物分别进行PCR和测序即可获得该细胞线粒体DNA的序列，因此为研究提供方便。mtDNA分编码区和非编码区，即D—环区。D-环区包括重链的复制起点等重要序列，成为研究热点。本课题组前期已完成以大肠癌细胞／组织、癌旁正常组织以及大肠癌患者和正常人外周血白细胞为对照，通过PCR、PCR-SSCP等技术分析大肠癌细胞／组织以及癌旁组织、大肠癌患者外周血白细胞mtDNA变异，包括点突变、缺失、DNA的不稳定性等变化的特征及规律；并构建人大肠癌细胞及正常人血白细胞线粒体DNA重组表达载体。本课题旨在通过将大肠癌细胞突变的mtDNA片断转染小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3），观察转染细胞的mtDNA改变的特点和mtDNA片段在成纤维细胞核内的整合情况，及进一步观察转染细胞生物学行为的改变，并把转染细胞接种于裸鼠，观察转染细胞的致瘤作用及mtDNA在成瘤细胞核内的整合。以便明确变异的mtDNA造成大肠癌发病的机制和作用。方法1．通过双酶切和单酶切，ABI377测序仪全自动正反双向测序，并与线粒体基因库数据对照（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），鉴定已构建的突变的大肠癌pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1（+）-Lovo mtDNA、pcDNA3.1（+）-NHWBC mtDNA重组载体及pcDNA3.1（+）空载体。2．通过脂质体法(lipofection2000TM)，将大肠癌细胞突变的mtDNA真核表达载体转染NIH3T3细胞，利用G418抗性筛选；用荧光标记的染色体原位杂交（FISH）观察mtDNA在核内的整合情况；观察转染前后细胞异型性及进行染色体核型分析；PCR法检测转染细胞线粒体突变情况；流式细胞仪（FCM）检测转染细胞的凋亡情况；用四唑盐比色法（MTT）测定在不同时间、不同组间细胞增殖的吸光度值，用SPSS10.0软件，定量数据重复测量的方差分析法，进行统计学分析。3．将稳定阳性克隆细胞株接种于BALB／C裸鼠皮下，观察转染细胞的致瘤作用。结果1．已构建的真核表达载体通过鉴定可以用于细胞转染。2．转染NIH3T3细胞，经G418筛选，获得了2个不同细胞株mtDNA及空载体的稳定的3株阳性克隆转染细胞株，并进行了大量扩增。3．设计并合成3对绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针，用FISH法检测mtDNA探针能在NIH3T3／Sw480-mtDNA、NIH3T3／NHWBC-mtDNA及NIH3T3／vector细胞核内整合。4．转染突变的大肠癌细胞mtDNA后的NIH3T3细胞的染色体核型较未转染的NIH3T3细胞的染色体核型有显著的变化。5．突变的mtDNA转染NIH3T3细胞后，影响转染细胞的凋亡。6．将转染不同重组质粒的NIH3T3细胞和空NIH3T3细胞mtDNA D-loop的序列分别和未转染的NIH3T3细胞及基因库数据（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer）比对，分别检测到NIH3T3／Sw480-mtDNA共有11个位点变化，包括4个突变，7个多态性变化，NIH3T3／NHWBC-mtDNA共有8个位点变化，包括1个突变，7个多态性变化，NIH3T3／vector共有8个位点变化，包括1个突变，7个多态性变化。7．定量数据重复测量的方差分析法分析mtDNA转染NIH3T3细胞前后的吸光度OD570，P＜0.05，不同时间、组间细胞增殖水平及其相互之间有显著性差异。8．已构建的3株阳性克隆转染细胞株的软琼脂克隆形成率间有显著性差异。9．将1×106个稳定阳性克隆细胞接种于BALB／C裸鼠皮下，4—6周后未引发肿瘤。结论1．突变的大肠癌mtDNA可通过影响NIH3T3细胞的mtDNA的突变、多态性和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响NIH3T3细胞的染色体核型、增殖水平、凋亡率变化等细胞生物学行为，此突变的mtDNA在核基因组内整合后，是否可能诱发或阻滞细胞信号转导MAPK通路，尚有待进一步的课题研究。2．肿瘤的发生是一个多因素作用、多阶段的复杂过程，转染突变的大肠癌mtDNA后，可以在一定程度上提高NIH3T3细胞的恶性程度，但不足以引发裸鼠肿瘤形成。