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背景与目的大肠癌(Colorectal carcinoma)是消化系统常见的恶性肿瘤之一,发病率在全球常见恶性肿瘤中居第四位,在我国恶性肿瘤发病率中居第四位。大肠癌是涉及许多相关基因的多因素多阶段的恶性肿瘤,研究发现不仅取决于核内遗传物质,而且还与核外的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)关系密切。mtDNA是细胞内唯一的核外遗传物质,具有可自主复制的DNA基因组。大肠癌细胞的mtDNA改变,国内未见有文献报告,国外虽有文献报告,但却意见不一,不尽相同。Savre—Train等在结肠癌细胞系Caco中检测到2583bp大片段的缺失,缺失为1%,而未检测到基因突变及线粒体基因组不稳定性(mitochondrial genomic instability,mtGI)。Heerdt等研究发现,在结肠癌细胞mtDNA的D-loop区存在基因组的多态性,而未发现mtDNA的突变及mtGI。而在Habano对45例结肠癌和正常组织的mtDNA的研究中,发现有7/45(16%)存在突变,包括3例编码ND1和ND5的移码突变,2例错义突变,15bp的缺失,而没有大片段的缺失,并且进一步研究发现其中22例mtDNA的D-loop区存在(CA)n不稳定及多聚C不稳定,并且认为其与线粒体基因组的错配修复系统有关。与核基因的错配修复系统一样,上述mtDNA基因组不稳定的存在跟肿瘤的发生有密切的关系。人类的线粒体基因组DNA全长也仅仅16Kb,而且序列早已完全清楚,只要通过设计适当的引物分别进行PCR和测序即可获得该细胞线粒体DNA的序列,因此为研究提供方便。mtDNA分编码区和非编码区,即D—环区。D-环区包括重链的复制起点等重要序列,成为研究热点。本课题组前期已完成以大肠癌细胞/组织、癌旁正常组织以及大肠癌患者和正常人外周血白细胞为对照,通过PCR、PCR-SSCP等技术分析大肠癌细胞/组织以及癌旁组织、大肠癌患者外周血白细胞mtDNA变异,包括点突变、缺失、DNA的不稳定性等变化的特征及规律;并构建人大肠癌细胞及正常人血白细胞线粒体DNA重组表达载体。本课题旨在通过将大肠癌细胞突变的mtDNA片断转染小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3),观察转染细胞的mtDNA改变的特点和mtDNA片段在成纤维细胞核内的整合情况,及进一步观察转染细胞生物学行为的改变,并把转染细胞接种于裸鼠,观察转染细胞的致瘤作用及mtDNA在成瘤细胞核内的整合。以便明确变异的mtDNA造成大肠癌发病的机制和作用。方法1.通过双酶切和单酶切,ABI377测序仪全自动正反双向测序,并与线粒体基因库数据对照(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),鉴定已构建的突变的大肠癌pcDNA3.1(+)-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1(+)-Lovo mtDNA、pcDNA3.1(+)-NHWBC mtDNA重组载体及pcDNA3.1(+)空载体。2.通过脂质体法(lipofection2000TM),将大肠癌细胞突变的mtDNA真核表达载体转染NIH3T3细胞,利用G418抗性筛选;用荧光标记的染色体原位杂交(FISH)观察mtDNA在核内的整合情况;观察转染前后细胞异型性及进行染色体核型分析;PCR法检测转染细胞线粒体突变情况;流式细胞仪(FCM)检测转染细胞的凋亡情况;用四唑盐比色法(MTT)测定在不同时间、不同组间细胞增殖的吸光度值,用SPSS10.0软件,定量数据重复测量的方差分析法,进行统计学分析。3.将稳定阳性克隆细胞株接种于BALB/C裸鼠皮下,观察转染细胞的致瘤作用。结果1.已构建的真核表达载体通过鉴定可以用于细胞转染。2.转染NIH3T3细胞,经G418筛选,获得了2个不同细胞株mtDNA及空载体的稳定的3株阳性克隆转染细胞株,并进行了大量扩增。3.设计并合成3对绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针,用FISH法检测mtDNA探针能在NIH3T3/Sw480-mtDNA、NIH3T3/NHWBC-mtDNA及NIH3T3/vector细胞核内整合。4.转染突变的大肠癌细胞mtDNA后的NIH3T3细胞的染色体核型较未转染的NIH3T3细胞的染色体核型有显著的变化。5.突变的mtDNA转染NIH3T3细胞后,影响转染细胞的凋亡。6.将转染不同重组质粒的NIH3T3细胞和空NIH3T3细胞mtDNA D-loop的序列分别和未转染的NIH3T3细胞及基因库数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer)比对,分别检测到NIH3T3/Sw480-mtDNA共有11个位点变化,包括4个突变,7个多态性变化,NIH3T3/NHWBC-mtDNA共有8个位点变化,包括1个突变,7个多态性变化,NIH3T3/vector共有8个位点变化,包括1个突变,7个多态性变化。7.定量数据重复测量的方差分析法分析mtDNA转染NIH3T3细胞前后的吸光度OD570,P<0.05,不同时间、组间细胞增殖水平及其相互之间有显著性差异。8.已构建的3株阳性克隆转染细胞株的软琼脂克隆形成率间有显著性差异。9.将1×106个稳定阳性克隆细胞接种于BALB/C裸鼠皮下,4—6周后未引发肿瘤。结论1.突变的大肠癌mtDNA可通过影响NIH3T3细胞的mtDNA的突变、多态性和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响NIH3T3细胞的染色体核型、增殖水平、凋亡率变化等细胞生物学行为,此突变的mtDNA在核基因组内整合后,是否可能诱发或阻滞细胞信号转导MAPK通路,尚有待进一步的课题研究。2.肿瘤的发生是一个多因素作用、多阶段的复杂过程,转染突变的大肠癌mtDNA后,可以在一定程度上提高NIH3T3细胞的恶性程度,但不足以引发裸鼠肿瘤形成。