背景心力衰竭(Heart Failure, HF)是一种由于各种器质性或功能性心脏疾病使心室或射血能力受损的综合症,其病死率约50%,已成为21世纪最重要的心血管病症。在过去三十年,急性心梗的病死率已经有所下降,但心衰的伴发率却持续升高,已严重影响了人类健康。对于心衰的了解,早在2000年前就被希腊Hippocrates所描述,但对其治疗,虽然取得了一定的进展,却一直不理想,因此,如何治疗心衰,阻止心衰的病程发展一直是医学研究的热点问题。HF的发病是由多种因素决定的,早在1939年,Herrmann和Decherd发现慢性心衰心肌中肌酸含量明显降低,因而提出在慢性心衰时存在心肌能量的耗竭。目前越来越多的临床研究和实验研究均显示,衰竭的心脏都存在着心肌能量的耗竭,因而能量代谢在心衰进展中起着非常重要的作用。事实上,心肌能量代谢障碍是心衰的重要标志之一。研究显示,心肌能量缺乏、代谢酶类过表达以及基因的异常能够引起左心室重塑,是心衰进展中必不可少的因素。在胎儿时期,葡萄糖作为代谢底物的主要供能者,游离脂肪酸氧化率很低。提供ATP的量很少,心脏中的糖酵解是能量的主要来源,并且糖酵解酶类具有更高的活性。出生后游离脂肪酸的氧化率增长了10倍,同时葡萄糖的氧化率下降,而心衰晚期游离脂肪酸氧化减少葡萄糖氧化增加,这恰好和一些研究观察到的结果相反。如果新生儿罹患心肌肥大,脂肪酸氧化的关键酶类活性及表达将保持“胎儿状态”。许多参与脂肪酸氧化的关键酶类在从胎儿代谢状态转化到成人状态时都发生了改变,表明对应于慢性心肌应力(变化)而发生的不是一个简单的胎儿代谢调节的转变。心衰状态下代谢重塑的影响不但与脂肪酸供给的代谢底物的转变有关,而且还与代谢中的关键酶类的“胎儿化”有关。可见,心衰实质上是由于能量不足造成基因表达异常而引起的一种超负荷性心肌病。对心衰心肌中高能磷酸化合物的检测也证实,与能量代谢障碍相伴的心室重构是心衰的主要病理生理学机制。能量代谢障碍贯穿于心肌从代偿性肥大到最终衰竭的全过程中,是心衰发生、发展和恶化的重要因素。鉴于心衰的发展与心肌机械收缩力学以及心肌力能学障碍和紊乱等众多因素有关,有学者提出可通过调整心肌能量代谢的方法来治疗心衰和提高心肌工作效率。纠正代谢失衡的疗法可能为心衰及心肌缺血等与力能学过程紊乱有关的疾病的治疗开辟出一条新的治疗途径。到目前为止,一些直接改善心肌能量代谢的药物已被证实能够提高心衰患者的心功能。因此,研究改善能量代谢的措施,对于防治心衰的发生发展具有重要意义,甚至Stephan等认为未来心衰治疗的一个目标就是改善心肌的能量代谢。运用中药益气法治疗心衰的理念与改善衰竭心脏能量代谢有共通之处。从黄芪中所提取出的黄芪甲苷,黄芪多糖,黄芪总提物都对心功能改善均具有很好的作用,目前在临床上被广泛用于治疗心脏疾患。研究表明,黄芪甲苷主要是通过其抗氧化作用而保护心脏功能。虽然有研究展示黄芪等补气中药及/或有效成分也有调节其他组织器官脂质和糖代谢的功能,但对于其是否通过直接参与调解心肌细胞能量底物的选择、利用及产能而发挥其改善心脏功能尚无人涉足。故研究从心肌机械收缩力学以及心肌力能学(能量代谢)的角度,通过比较黄芪总提物及黄芪有效成分治疗后的一系列变化,包括心肌收缩做功、心肌对能量底物如游离脂肪酸、葡萄糖、丙酮酸和乳酸等的选择及利用、心肌氧耗、心肌能量(底物)转运体、心肌能量代谢的关键酶类等的改变,系统探讨黄芪总提物及黄芪有效成分对阿霉素所致心衰的保护机制。从而为补气中药治疗心衰的机制从一个新的视角上提供更新的科学依据和研究示范。这种纠正能量代谢失衡的方法可能为中医药治疗心衰及心肌缺血等与力能学过程紊乱有关的疾病开辟出一条新的治疗途径。目的采用阿霉素致实验性心衰大鼠模型为对象,通过电生理技术,分子生物学技术,HPLC及试剂盒检测技术,从心肌收缩机械力学和力能学角度,观察包括心肌能量底物的选择、氧耗、中间产物的转运、能量代谢的关键酶类、能量的储存和利用等,系统探讨黄芪总提物及黄芪有效成分(黄芪皂苷/黄芪多糖等)保护实验性心衰心肌功能损伤的科学机制。方法本研究将SD大鼠分为7组,包括正常(Control)组、HF组、地高辛(Digoxigein,DG)、黄芪甲苷(Astragaloside, ASIV)组、黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide, APS)组、黄芪总皂苷(Total Saponins of Astragalus, AST)组、黄芪总提物(Astragalus Extract Mixture, AEM)组,除HF组18只大鼠外,其余各组均12只,采用阿霉素(或称盐酸多柔比星,Adriamycin, ADR)制造心衰模型,分别给予生理盐水(正常组)及治疗药物(地高辛及黄芪单体,总提物),从能量代谢的角度观察其对HF的治疗作用及机制。实验主要包括以下疗效确定和作用机制研究两个部分。1疗效确定采用langendroff灌流系统,观察比较正常组、模型组及治疗组大鼠一般状态、生存率、心重/体重等基本状态及心脏机械力学指标,包括左心室收缩压(Left Ventricular Systolic Pressure, LVSP)、左心室舒张终末压(Left Ventricular End-diastolic Pressure, LVEDP)、心率(Heart Rate, HR)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等的变化,以确定黄芪总提物及黄芪有效成分对改善实验性心衰心脏功能的作用效果。2机制研究21黄芪总提物及黄芪有效成分改善心衰心脏功能的力能学基础于前部分疗效确定工作的同时,分别检测比较各组大鼠心脏灌流前后的灌流液中能量底物包括葡萄糖、游离脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA)和丙酮酸的摄取利用、氧分压以及乳酸生成量等的改变情况,并与心肌收缩功能相联系,从力能学角度进一步探讨。2.2黄芪总提物及黄芪有效成分改善心衰心肌力能学的机制研究在上述工作的基础上,进一步采用分子生物学、HPLC检测等技术手段,对心肌能量底物利用、能量的产生、转运及储存等相关的关键酶类、转运体以及能量储存量等进行检测并比较,主要包括如下内容：2.2.1探讨黄芪总提物及黄芪有效成分是否通过影响能量代谢底物转运体而改善心脏功能的作用分别检测包括游离脂肪酸转运过程中所涉及到的脂肪酸转运体(Fatty Acid Translocase, FAT)、转运体膜结合脂肪酸蛋白(Plasma Membrane-associated Fatty Acid Binding Protein, FABPpm)及位于线粒体膜上的肉毒碱棕榈酰转移酶(Carnitine Palmitoyltransferase, CPT)以及电子传递链过程中的脱偶联蛋白(Mitochondrial Uncoupling Protein, UCP)的基因表达。2.2.2阐明黄芪总提物及黄芪有效成分是否通过影响能量代谢酶类而改善心脏功能的作用检测包括糖酵解过程的关键酶6磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, PFK),丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase, PK),脂肪酸β氧化过程中的关键酶中链辅酶A脱氢酶(Medium-chain acyl-CoA Dehydrogenase, MACD)、长链辅酶A脱氢酶(Long-chain acyl-CoA Dehydrogenase, LCAD)以及磷酸肌酸和肌酸转化过程中的酶一肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)基因表达的变化。2.2.3阐明黄芪总提物及黄芪有效成分是否通过影响能量利用及其储存而发挥作用分别检测和计算能量池——磷酸肌酸(Phosphocreatine, PCr)、直接供能物质ATP及产生能量的底物ADP的变化。结果1疗效确定机械力学指标的检测结果表明：黄芪总提物及黄芪有效成分均可明显改善大鼠一般状态,使HF症状减轻；除APS组外,均显著提高ADR致HF大鼠的存活率(P<0.01或P<0.05,)；除AEM组外,均能增加心脏/体重比值(P<0,01或P<0,05)；均能显著提高LVSP(P<0.01)及+dp/dtmax(除APS组P<0.05外,均P<0.01)；亦能显著提高心脏做功指标一心率脉压乘积(Rate-Pressure Product, RPP),与HF组比差异显著(P<0.01)；其中AEM组还可以增加HR(P<0.01),同时缩短T-dp/dtmax(O.Ol),表明其心脏收缩力学改善作用更为明显,且明显强于阳性对照药物DG(P<0.01或P<0.05)。有效成分ASIV和AST作用大致相仿,而APS组亦能显著提高LVSP及+dp/dt max,对HF具有一定的治疗作用。2机制研究2.1黄芪总提物及黄芪有效成分改善心衰心脏功能的力能学基础本实验结果显示,阿霉素所致实验性心衰后心肌对能量代谢利用发生紊乱并产生障碍,心肌由利用游离脂肪酸转向利用葡萄糖为主,这与心肌机械收缩力学障碍相伴随。黄芪总提物及黄芪有效成分均可明显提高氧气的摄取和利用(P<0.05或P<0.01)；提高游离脂肪酸及丙酮酸的摄取和利用(P<0.01或P<005)；降低对葡萄糖的摄取和利用,提高做功与葡萄糖摄取的比值(P<0.01)；除APS外,均能提高做功与摄取丙酮酸之比(P<0.01)；显著减少乳酸堆积现象(P<0.01或P<0.05)；使得心肌做功与摄取葡萄糖比上FFA之比亦显著升高(P<001)；表明黄芪总提物及黄芪有效成分能在一定程度上缓解HF心肌能量代谢紊乱现象,其中ASIV组对游离脂肪酸的摄取,AEM组对葡萄糖的摄取改善作用更为明显(P<0.01)。2.2黄芪总提物及黄芪有效成分改善心衰心肌力能学的机制2.2.1黄芪总提物及黄芪有效成分对心衰心肌能量代谢酶类的影响实验结果表明,心衰后心肌PFK含量显著升高,大约为Control组的1.3倍(P<0.01),但各治疗组与HF组比较均无统计学差异；各组大鼠心肌中PK的含量变化并不明显(P>0.05),提示该酶可能没有参与介导黄芪总提物及黄芪有效成分保护HF心肌的作用；HF组线粒体脂肪酸β氧化的关键酶类的含量都普遍降低,其中MCAD的表达约下降到Control组50%。ASIV及AEM组能够提高HF心肌中MCAD含量(P<0.01)；ASIV及AEM组同样显示出能够提高LACD基因表达的作用(P<0.01),使之趋近于Control组的水平,而APS组此作用不明显；HF组大鼠心肌中CKMB的含量显著升高(P<0.01),APS及AEM能够显著降低其含量(P<0.05)。2.2.2黄芪总提物及黄芪有效成分对心衰心肌能量代谢底物转运体的影响本实验结果表明,HF组中UCP表达升高,升幅约为Control组的50%；治疗组中APS及AEM组能显著降低UCP的含量(P<0.01),减少能量在传递过程中的损失；HF组CPT-I的含量显著下降,为正常组的0.32倍(P<0.01),而黄芪总提物及黄芪各有效成分均能显著增加其表达(P<0.01),尤其是ASIV组及AEM组比阳性对照药物DG组效果还要好(P<0.01),提示黄芪总提物及其有效成分可通过影响CPT的表达而起到保护心肌损伤的作用；HF组FAT-CD36表达显著下降,而治疗组中ASIV组及AEM组则可显著增加FAT-CD36含量(P<0.01),使之达到与Control组相仿的水平,而DG组及APS组与HF组差别不大,未见明显的统计学差异；对于FABP蛋白,HF后其含量显著降低(P<0.01),但黄芪总提物及黄芪各有效成分治疗组与HF组比较无统计学差异(P<0.05)。223黄芪总提物及黄芪有效成分对心衰心肌能量利用及其储存的影响实验结果表明,虽然ATP的含量在各组间变化不显著(P>0.05),但HF组与Control组比较,PCr的含量明显下降(P<0.01),这一结果提示HF虽然尚未严重影响ATP含量,但已经产生了从线粒体ATP向能量池PCr储存能力障碍。治疗组ASIV及AEM组能够显著增加HF状态下PCr含量(P<001),使其趋近于Control组,改善能量储存不足的现象；HF组大鼠心肌中ADP含量与正常组比较,亦见明显下降(P<0.01),AST则能够增加ADP含量(P<0.05),而其他治疗组如DG、 APS及AEM组等虽然也可小幅度提高ADP含量,但与HF组比较未见明显差异(P<0.05),因此不能肯定上述治疗组可以通过调整ADP含量来发挥其治疗和保护作用。结论1.黄芪总提物及黄芪有效成分均可明显改善ADR所致HF大鼠一般状态,增加心脏／体重比,可明显提高其存活率,改善心肌收缩机械力,进而改善其左心室做功状况。2.HF后存在心肌能量底物利用的紊乱,出现游离脂肪酸供能代谢比例下降和葡萄糖代谢功能比例增加的“胚胎化”现象,上述心肌供能代谢的紊乱可能是HF心肌机械收缩功能受损的基础。3黄芪总提物及黄芪有效成分均在很大程度上逆转ADR致HF过程中的各种能量代谢紊乱和底物利用障碍,改善HF心肌力能学,从而保护心衰受损的心肌,而无多余负性的血流动力学效应。4.黄芪总提物及黄芪有效成分通过减少能量代谢底物转运体中UCP、增加CPT-I及FAT-CD36的表达,从而起到对ADR致HF的保护作用。5.增加能量代谢酶类中MCAD、 LACD及减少CKMB的基因表达可能是黄芪总提物及黄芪有效成分纠正ADR所致HF时的心肌力能学紊乱的机制之一,由此而进一步改善其受损的心肌机械收缩力学性能。6.提高线粒体ATP向能量池PCr的储存能力及调节ADP含量可能也参与介导了黄芪总提物及黄芪有效成分纠正ADR所致HF时的心肌力能学紊乱,从而进一步改善其受损的心肌机械收缩力学性能。总之,黄芪总提物及黄芪有效成分可以通过调节阿霉素所致的实验性心衰心肌能量代谢过程中的关键酶类、能量代谢相关转运体以及能量产生/储存相关因素,从而纠正心衰时心肌能量底物选择和利用等力能学过程的紊乱,并最终改善心衰心肌的机械收缩力学性能。