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目的:构建C57BL/6小鼠MHC-I分子真核表达质粒,转染293T细胞并鉴定其表达,为研究分子嵌合诱导移植免疫耐受奠定基础。方法:①采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法获取供体C57BL/6小鼠MHC-I基因H-2Db和H-2Kb。②通过双酶切、定向克隆技术将H-2Db和H-2Kb克隆入真核双表达质粒pIRES,构建重组质粒pIRES-H2Db-H2Kb。③使用Lipofectamine2000将重组质粒转染293T细胞,同时设置未转染组,转空质粒组。④荧光实时定量PCR检测转染后各组H-2Db和H-2Kb在mRNA水平表达情况。⑤流式细胞术检测转染后各组H-2Db和H-2Kb在蛋白水平表达情况。结果:①成功获取C57BL/6小鼠MHC-I分子H-2Db及H-2Kb的等位基因。②构建的C57BL/6小鼠MHC-I分子真核表达质粒经限制性双酶切鉴定成功正向插入pIRES质粒载体,经测序分析,克隆的基因与Genbank C57BL/6小鼠H-2Db和H-2Kb基因序列完全相同。③使用脂质体法成功将重组质粒pIRES-H2Db-H2Kb转染293T细胞。与未转染组和转染空质粒组相比,转染重组质粒组H-2Db和H-2Kb基因mRNA表达分别增加632倍和904倍,差异有统计学意义(P<0.01)。而未转染组与转染空质粒组之间差异无统计学意义(P>0.05)。④转染重组质粒组H-2Db和H-2Kb基因蛋白表达分别为(24.50±1.88)%和(34.30±2.68)%,明显高于转染空质粒组[H-2Db(0.42±0.05)%;H-2Kb(0.12±0.03)%]及未转染组[H-2Db(0.38±0.03)%;H-2Kb(0.10±0.02)%],差异具有统计学意义(P<0.01),而转染空质粒组和未转染组之间蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建C57BL/6小鼠MHC-1分子真核双表达载体pIRES-H2Db-H2Kb,并实现其在293T细胞中的表达。