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背景和目的特发性肺动脉高压(Idiopathic pulmonary artery hypertension, IPAH,原名原发性肺动脉高压)是一种恶性肺血管疾病,其基本病理特点是远端肺小动脉内膜增生、丛样病变、中膜肥厚、肌化和血栓形成,管腔逐渐闭塞,肺动脉压进行性升高,最终导致右心衰竭。近年来,血管内皮细胞、平滑肌细胞在肺动脉高压(PAH)的形成和发展中的作用倍受关注,认为内皮细胞结构、功能、代谢的改变是PAH发展、演变中重要的特征。内皮细胞的损伤、激活及合成的多种因子,参与了肺血管的过度收缩与重构。内皮细胞损伤后,释放一氧化氮(Nitric oxide, NO)、前列环素(Prostacyclin, PGI2)等血管舒张物质减少,而释放内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、血管紧张素(Angiotensin, Ang)等血管收缩物质增多。因此,恢复内皮依赖性的血管舒张物质与收缩物质之间的平衡是治疗PAH的病理生理基础。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPC)是一类能分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞,不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。近年来,EPC移植治疗PAH引f起国内外学者极大的兴趣,已成为一个新的研究热点。动物实验显示EPC移植可以减轻PAH大鼠、犬的肺动脉压力。我们在动物实验的基础上开展了世界上首个EPC移植IPAH.患者的临床试验研究,结果显示EPC移植治疗IPAH是有效而安全的。但移植细胞在宿主体内的作用机制目前尚不明确。既往研究大多认为是移植细胞直接参与血管生成和内皮修复。但是PAH患者肺组织本身不乏血管新生,且部分患者有内皮过度增生(丛样病变),因而血管新生可能不足以完全解释移植细胞对病损肺血管的保护效应。因此,本研究目的是探讨骨髓源性内皮祖细胞(Bone marrow derived endothelial progenitor cells, BMEPC)是否可以通过旁分泌机制促进血管内皮依赖性的血管舒张物质的生成,从而发挥对PAH肺血管的保护效应,并进一步明确其可能的信号转导机制。实验方法采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中获取单个核细胞,经分离纯化接种在人纤维连接蛋白包被的培养板内,培养7天后,收集贴壁细胞并染色鉴定BMEPC。采用ELISA检测BMEPC条件培养基(Conditioned medium, CM)中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factors, VEGF)的水平。在体外实验中,F344雄性大鼠50只,随机取10只分为对照组,余40只采用野百合碱(Monocrotaline, MCT60mg/kg)剂量一次性腹腔注射,以诱导大鼠慢性PAH模型,在注射21天后用右心测压导管检测右心室收缩压(Right heart systolic pressure, RVSP)的变化,以鉴定慢性PAH大鼠模型。PAH大鼠肺动脉环经BMEPC或BMEPC-CM孵育后,用血管环灌流实验观察血管反应性的改变,用Western blot法检测环加氧酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)、环加氧酶-1(Cyclooxygenase-1, COX-1)、 PGI2合酶(Prostacyclin synthase, PGIS)的蛋白表达,以及放免法检测细胞内环磷腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的水平。在体内实验中,雄性大鼠60只,随机取15只分为假手术对照组,余45只用MCT诱导大鼠慢性PAH模型,21天后随机分为BMEPC移植组(n=15)：标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的BMEPC经颈静脉移植入PAH大鼠肺循环中；BMEPC-CM移植组：(n=15)；和Medium199(M199)培养基移植组：(n=15)；假手术对照组用M199注射。细胞移植21天后,检测体重、RVSP、肺/体重(Lung/Body Weight, L/BW)、右心室/左心室+室间隔(Right ventricular/left ventricular and septum weight, RV/LV+IVS)及形态学改变；采用Western blot(?)去检测(?)COX-2、COX-1、PGIS、内皮型一氧化氮合酶(Endothelial NO synthase,eNOS),诱导型一氧化氮合酶(Inducible NO synthase,iNOS)的蛋白表达；采用ELISA(?)去及放免法分别检测6-酮-前列腺素-Fla(6-keto-Prostaglandin Fla,6-keto-PGF1a)、血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2).前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)及cAMP水平；采用免疫组化检测COX-2蛋白在肺动脉中的表达及分布。结果在体外实验中,大鼠在MCT注射21天后与正常对照组相比,出现体重减轻、活动度下降、呼吸急促等表现。经检测,BMEPC-CM中的VEGF浓度明显高于对照组骨髓源性单个核细胞条件培养基(Bone marrow derived mononuclear cells-conditioned medium, BMMNC-CM)。肺动脉经BMEPC孵育24小时后,内皮依赖性血管舒张功能明显改善,且被COX-2抑制剂——NS398抑制。BMMNC孵育后未改善血管舒张功能。Western blot检测显示：BMEPC及BMEPC-CM孵育后COX-2.PGIS的蛋白表达明显增加,而COX-1的蛋白表达在各组间无明显差异。BMEPC孵育提高肺血管细胞内cAMP水平。在体内实验中,MCT注射42天后体重与正常对照组相比明显减轻(265.17±4.48g vs.329.33±15.18g, P＜0.01); RVSP明显高于正常对照组(62.37±1.98mmHgvs.25.42±0.95mmHg, P＜0.01); RV/LV+IVS与正常对照组相比明显增高(0.59±0.03vs.0.26±0.03, P<0.01); L/BW与正常对照组相比也明显增高。移植BMEPC未能使体重增加,但显著降低RVSP、RV/LV+IVS及L/BW。组织病理学检查显示：MCT组大鼠的细支气管旁的小肺动脉中膜严重增厚,管腔几近闭塞,而BMEPC组小肺动脉中膜增厚明显减轻。Western blot检测显示：与正常对照组相比,MCT组COX-2、PGIS、eNOS的蛋白表达下调,而COX-1及iNOS的蛋白表达在各组间无明显差异。移植BMEPC及BMEPC-CM能增加COX-2、PGIS的蛋白表达,并提高6-keto-PGF1α及cAMP水平。免疫组化检测显示：MCT组COX-2蛋白表达降低,BMEPC及BMEPC-CM组表达增加,且分布于血管各层。结论BMEPC体外孵育可改善PAH大鼠受损的肺血管内皮舒张功能,BMEPC在体移植可降低PAH大鼠的肺动脉压力,并改善肺血管重构。其机制可能是BMEPC通过旁分泌VEGF等细胞活性因子,上调COX-2、PGIS的表达,进而增加细胞内cAMP的水平。