论文部分内容阅读
目的：
基因敲除技术(Gene Knockout)是一种新型分子生物学技术,是利用DNA同源重组使细胞中特定的基因失活或缺失的技术。该技术自上世纪80年代末诞生以来,已被广泛应用于功能基因组学等研究领域。由于小鼠基因组与人类基因组具有高度相似性,通过该技术构建出来的基因敲除小鼠模型已成为研究人类疾病强有力的工具和手段。
先天性全身终毛增多症(Congenital Generalized Hypertrichosis Terminalis,CGHT,MIM ID＃135400)是一种非常罕见的人类疾病,俗称“狼人综合征”(Werewolf Syndrome)。其特点是非雄激素依赖性全身性毛发过度生长,常伴发牙龈增生和面部特征畸形,且不受性别、年龄和种族限制,曾一度被认为是一种返祖现象(Atavism)。2009年,本课题组在国际上首次确定人类染色体17q24.2-q24.3区域拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)对CGHT发生起到决定性作用,并提出该区域内的Map2k6等4个蛋白编码基因为CGHT的致病候选基因,但该病发生的具体分子机制仍不甚明了,而且病例少、病理组织取材困难等限制无疑又进一步增加了研究的难度。
作为CGHT致病主要候选基因之一的Map2k6基因,负责编码促分裂原活化蛋白激酶激酶蛋白。但据文献报道,一名包含有Map2k6基因在内的染色体17q24.2-q24.3区域微缺失的病人并没有出现CGHT相关的疾病特征。并且,Map2k6基因敲除小鼠模型同样也没有表现出明显的毛发生长方面的异常。但值得注意的是,目前构建的Map2k6基因敲除模型主要是敲除该基因的编码序列以破坏其蛋白表达,而针对该基因区域潜在调控相关元件的研究甚少。小鼠的Map2k6基因位于染色体11qE2区域,通过比较基因组学研究我们发现,该基因区域染色体位置110,260,185-110,264,752和110,362,441-110,367,890(UCSC数据库July2007,NCBI37/mm9)各有一段保守的区域,并且其3非编码区染色体位置110,378,469-110,387,006有一段表达序列标签(Expressed Sequence Tags,EST)集中的区域,而此类区域常被认为具有调控基因转录和翻译等重要的功能。
本课题旨在针对上述三个DNA片段分别构建基因打靶载体,并用于产生基因敲除小鼠胚胎干细胞克隆,进而生成相应的基因敲除小鼠模型。该敲除模型的建立将有助于了解Map2k6基因本身及其对邻近基因表达可能存在的调控模式,进而为将来最终阐明CGHT的具体分子发病机制奠定基础。
方法：
1、对小鼠Map2k6基因区域进行比较基因组学分析,确定该基因的5非翻译区(Untranslated Region,UTR)至内含子1、内含子10以及3非编码区三段敲除区域,即染色体11qE2位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378,469-110,387,006(UCSC数据库July2007,NCBI37/mm9),大小分别为4,568 bp、5,450 bp、8,538 bp,并在理论上设计针对上述三个区域的置换型基因打靶载体。
2、以覆盖以上区域的BAC克隆DNA为模板,利用PCR分别扩增三个打靶载体对应的六段同源臂序列,并按照理论设计的先后顺序分别在基因敲除通用载体pL452骨架上安装每个打靶载体两侧的同源臂,最终通过测序确认打靶载体的序列信息正确。
3、复苏小鼠胚胎干细胞系AB2.2和JMSA3,并培养调整到良好的生长状态,取部分细胞做囊胚注射来验证其多能性(Pluripoteney)。然后,利用电穿孔(Electroporation)的方法将线性化的三个基因打靶载体分别导入AB2.2和JM8A3中,在G418药物筛选后,挑选存活下来并具有良好细胞形态的细胞克隆进行培养、增殖和保存。最后,提取这些细胞克隆的基因组DNA,利用PCR和SouthernBlot的方法从中鉴定出正确的基因敲除细胞克隆。
结果：
1、成功构建针对小鼠Map2k6基因区域、染色体11qE2区位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378,469-110,387,006,大小分别为4,568 bp、5,450 bp、8,538 bp的三个置换型基因打靶载体(分别命名为KO-1、KO-2和KO-3),其线性化后长度分别为14,585 bp、14,110 bp、12,630 bp,并均已测序确认。
2、将线性化的三个打靶载体导入小鼠胚胎干细胞系AB2.2和JM8A3中,经G418药物选择后,AB2.2分别生长出202、76、107个克隆,从中挑取96、44、48个克隆进行培养鉴定;JM8A3分别生长出305、176、193个克隆,从其中挑取180、129、156个克隆进行培养鉴定。目前,已获得7个KO-1基因敲除的JM8A3细胞克隆;KO-2和KO-3经过PCR初步筛选也分别得到了30和36个可能为同源重组阳性的ES细胞克隆,有待进一步鉴定。
结论：
本研究经初步鉴定获得了小鼠Map2k6基因区域三个片段,即染色体11qE2区位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378,469-110,387,006的DNA序列,被靶向敲除的三种小鼠胚胎干细胞系,并用于建立相应区域的“基因敲除”小鼠模型。