【摘 要】
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化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）是一种条件致病菌,可以感染猪、牛、羊等家畜,引起多种化脓性疾病,导致严重的经济损失。抗菌药物是治疗化脓隐秘杆菌感染的主要手段,但近年来研究发现,化脓隐秘杆菌耐药性越来越严重,并呈现多药耐药的趋势。Pat B是一种跨膜蛋白,属于三磷酸腺苷结合（ATP-binding cassette transporter,ABC）转运蛋白,Pat B蛋白可能
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化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）是一种条件致病菌,可以感染猪、牛、羊等家畜,引起多种化脓性疾病,导致严重的经济损失。抗菌药物是治疗化脓隐秘杆菌感染的主要手段,但近年来研究发现,化脓隐秘杆菌耐药性越来越严重,并呈现多药耐药的趋势。Pat B是一种跨膜蛋白,属于三磷酸腺苷结合（ATP-binding cassette transporter,ABC）转运蛋白,Pat B蛋白可能与细菌多药耐药相关。然而,化脓隐秘杆菌Pat B蛋白的生物学功能尚不清楚,因此,本研究构建化脓隐秘杆菌pat B基因缺失株,阐明Pat B的生物学功能,为化脓隐秘杆菌感染的防控提供依据。本研究以化脓隐秘杆菌临床分离株BMH06-3为研究对象,通过分析BMH06-3全基因组数据,获得了pat B基因在全基因组序列的位置和大小,pat B基因上游999 bp和下游999 bp分别为pat B基因的上、下游同源臂,以BMH06-3全基因组DNA为模板扩增pat B基因的上、下游同源臂,以质粒p BAVIK-T5-gfp为载体构建重组质粒p BAVIK-T5-gfp△pat B,将质粒p BAVIK-T5-gfp△pat B电转化BMH06-3感受态细胞中,构建化脓隐秘杆菌BMH06-3△pat B,并采用PCR技术和基因组测序对结果进行验证,分析BMH06-3△pat B菌株的生长状态、耐药表型、生物被膜以及转录水平的变化。本研究成功构建重组质粒p BAVIK-T5-gfp△pat B。以上游同源臂的上游引物和下游同源臂的下游引物对疑似基因缺失株进行PCR验证,结果表明疑似基因缺失株只扩增到同源臂基因,基因组测序未发现pat B基因,证明成功构建BMH06-3△pat B。在pat B基因缺失后BMH06-3的生长速率并无明显变化。采用微量肉汤稀释法测定15种抗菌药物对BMH06-3、BMH06-3△pat B和ATCC19411的最小抑菌浓度,试验结果表明pat B基因缺失后BMH06-3对15种抗菌药物的耐药表型无变化。采用结晶紫染色法测定BMH06-3和BMH06-3△pat B的生物被膜形成能力,pat B基因缺失后BMH06-3的生物被膜形成能力下降,观察发现pat B基因缺失后化脓隐秘杆菌生物被膜内的菌量减少、死菌增多、生物被膜厚度下降。转录组数据分析结果表明共有188个基因表达量增加,317个基因表达量减少,其中ABC转运超家族、群体感应系统和氧化磷酸化代谢通路等相关基因m RNA表达量出现差异,luxs、rbs A、rbs B、lsrk和plo的m RNA相对表达量的变化有可能导致BMH06-3生物被膜形成能力下降。本研究通过同源重组技术构建化脓隐秘杆菌pat B基因缺失株,并对pat B基因缺失株的生长速率、耐药表型、转录组水平和生物被膜形成能力进行研究,初步揭示了pat B基因对化脓隐秘杆菌生物被膜的影响,将为化脓隐秘杆菌病的防治提供思路。
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