目前研究发现,干酪不仅富含多种营养组分,在成熟过程中,干酪中的酪蛋白会被凝乳酶和乳酸菌的蛋白酶水解成大肽、游离氨基酸以及功能活性短肽,如抗氧化肽、ACE（血管紧张素转化酶）抑制肽以及免疫调节肽等,使干酪富含特殊的生理功能,这也引起了学者密切的关注。干酪中不仅含有原料乳中的乳酸菌,还含有外源添加的发酵剂乳球菌和非附属发酵剂乳酸菌,其中有一些乳酸菌被证实为益生菌。但干酪成熟期较长,有的可达数年之久,在前期产生的活性肽有可能会被进一步水解,同时为了促进干酪中生物活性肽的生成,也需要添加高水解活性的益生菌等非附属发酵剂,但人为干预添加外源性的益生菌,可能会使干酪菌群结构发生变化,从而影响干酪蛋白水解度和活性肽的生成,并且影响干酪质地,导致品质下降。因此,掌握干酪成熟期间菌群结构变化、活性肽的生成机理及结构特性,对获得高生物活性的干酪具有重要意义。本论文主要研究了干酪活性肽中的抗氧化肽和ACE抑制肽。首先,筛选了具有水解酪蛋白产肽潜力的益生菌,并研究了其水解系统中代表性蛋白酶的酶学特性,然后将具有产肽潜力的益生菌添加到契达干酪中,研究了成熟过程中益生菌对干酪菌群结构、氨肽酶活性、蛋白水解程度、抗氧化性及ACE抑制活性的影响,建立益生菌与干酪抗氧化性及ACE抑制活性的相关性,通过超滤、Sephadex G-25凝胶色谱和液质联用（LC-MS）对益生菌干酪抗氧化肽及ACE抑制肽进行分离鉴定,确定了益生菌水解干酪酪蛋白产肽的作用位点及两种肽的结构与活性。主要研究结果如下:（1）通过分析得出,9株益生菌中蛋白水解能力最强的前4株菌分别为瑞士乳杆菌（L.helveticus）1.0614、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）1.0386、瑞士乳杆菌（L.helveticus）1.0618和鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）1.0911,水解力分别为0.507±0.008、0.481±0.006、0.417±0.009和0.320±0.006。再通过复筛得出,L.helveticus 1.0614水解酪蛋白的肽得率、蛋白回收率显著高于其他菌株（P<0.05）,同时上述4株菌的酪蛋白水解产物均具有抗氧化性和ACE抑制活性,并随着水解时间增加而逐渐增强,其中L.helveticus 1.0614和L.rhamnosus 1.0386显著高于其他2株菌（P<0.05）,但两者的水解产物在DPPH清除率、还原能力以及ACE抑制活性上差异不显著（P>0.05）。因此,最终选择L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614作为接下来试验的益生菌。（2）通过分析L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614水解系统中胞壁蛋白酶（CEP）、广谱氨肽酶（Pep N）和X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶（Pep X）的酶学特性得出,两株菌的CEP活力分别为（59.28±1.03）U/mL和（63.57±1.03）U/mL,在三种蛋白酶中活力是最强的,并且L.helveticus 1.0614的CEP活力显著高于L.rhamnosus 1.0386（P<0.05）。通过以酪蛋白溶液为底物,研究蛋白酶与不同浓度底物作用时的酶活力得出,CEP对酪蛋白的亲和力最强。由此得出,CEP对酪蛋白的水解起主要作用。通过分析得出,L.rhamnosus 1.0386的CEP、Pep N和Pep X最适反应温度分别为40℃、45℃和35℃,最适反应pH值分别为6.5、7.0和7.0;L.helveticus 1.0614三种蛋白酶最适反应温度分别为45℃、40℃和45℃,最适反应pH分别为6.5、6.5和6.0。2株菌的蛋白酶在4⁴0℃,pH5.0⁷.0比较稳定。Na⁺、Ca²⁺和K⁺可显著增加蛋白酶的活性（P<0.05）。契达干酪的成熟温度一般为4¹2℃,体系pH为5.0左右,同时含有一定量的Na⁺和Ca²⁺,因此在一定程度上可促进益生菌蛋白酶的活性。（3）通过对契达干酪组成成分及品质分析得出,两株菌的添加对干酪组成成分不存在显著性影响（P>0.05）,符合契达干酪标准要求。在成熟180 d后添加益生菌的干酪硬度和凝聚性显著低于空白干酪（P<0.05）,但对干酪整体质地的接受性无影响。L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614在新鲜干酪中的活菌数分别为（8.03±0.06）log CFU/g和（7.92±0.13）log CFU/g,活性较高。在成熟期间两株菌的活菌数也一直呈现上升趋势,在240 d时活菌数分别可达（8.93±0.04）log CFU/g和（8.44±0.05）log CFU/g,由此也说明菌株胞壁蛋白酶也可保持较高含量。益生菌的添加使干酪菌群结构更加多样,主要增加了乳杆菌,而对乳酸乳球菌的生长没有影响,由于益生菌与粪肠球菌间存在菌株竞争,因此其显著降低了干酪中粪肠球菌的数量（P<0.05）。通过对干酪氨肽酶活性分析得出,在成熟120 d后,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614干酪的氨肽酶活性显著上升（P<0.05）。两组干酪的Pep N含量分别在150 d和210 d达到最大,Pep X含量均在150 d达到最大。在整个成熟期内,添加益生菌的契达干酪氨肽酶活性显著高于空白干酪（P<0.05）,这表明随着益生菌出现死亡,胞内氨肽酶在120d后逐渐参与到干酪蛋白水解过程中。同时,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614可显著促进干酪初级和二级蛋白水解（P<0.05）,在240 d时pH4.6-SN含量分别为（26.46±1.06）%和（28.37±1.55）%;12%TCA-SN含量分别为（25.64±1.14）%和（26.32±1.32）%,显著高于空白干酪（P<0.05）。在成熟180 d后,益生菌干酪5%PTA含量显著高于空白干酪（P<0.05）。三组干酪中添加L.helveticus 1.0614干酪的水解程度最高。由此可知,益生菌对干酪蛋白质初级水解有一定促进作用,有助于产生更多水溶性蛋白,并对其进行二级水解,产生可溶于12%TCA的多肽,成熟180 d后,在益生菌胞壁蛋白酶和氨肽酶共同作用下产生可溶于5%PTA的短肽和游离氨基酸,且水解能力强的菌株蛋白水解程度越高。（4）通过分析得出,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614干酪的抗氧化性随着成熟时间延长呈现上升趋势,且在240 d达到最大,DPPH清除力分别为（74.05±1.23）%和（80.12±1.53）%;羟自由基清除力分别为（71.2±1.33）%和（72.8±1.29）%;还原力分别为（0.592±0.023）和（0.602±0.124）,显著高于空白干酪（P<0.05）。在成熟0-60 d,添加L.rhamnosus 1.0386和L.helveticus 1.0614干酪的ACE抑制率显著增加（P<0.05）,增长率分别为52.2%和57.2%,并在240 d达到最大,ACE抑制率分别为（92.2±1.09）%和（95.1±1.22）%,显著高于空白干酪（P<0.05）,且添加水解能力较强的L.helveticus 1.0614的干酪,其活性最强。通过相关性分析得出,当干酪中添加益生菌后,益生菌的数量与干酪水解程度、抗氧化性及ACE抑制率存在一定相关性,但不显著（P>0.05）。与空白干酪相比,添加益生菌的干酪,其12%TCA-SN和5%PTA-SN与抗氧化性及ACE抑制率体现出显著正相关（P<0.05）,其中添加L.helveticus 1.0614干酪的5%PTA-SN与抗氧化性及ACE抑制率表现出极显著的正相关（P<0.01）。由此说明,干酪的抗氧化性和ACE抑制率主要与二级蛋白水解及产生的短肽含量有关,添加水解能力强的益生菌可显著促进干酪蛋白水解产生小分子活性肽,显著提高干酪抗氧化性及ACE抑制率（P<0.05）,且添加水解能力越强的菌株,产生的短肽越多。（5）通过对干酪不同超滤组分的抗氧化性及ACE抑制率分析得出,添加L.rhamnosus1.0386和L.helveticus 1.0614干酪中小于3 kDa的组分表现出最强的自由基清除力及ACE抑制率,DPPH清除力分别为（82.3±0.93）%和（89.4±0.32）%;羟自由清除力分别为（80.6±0.35）%和（82.3±0.65）%;还原力分别为0.592±0.022和0.501±0.031;ACE抑制率分别为（93.5±1.63）%和（96.7±0.32）%。由此可知,组分的分子量越低,其抗氧化能力及ACE抑制率越强。通过分析得出,益生菌干酪抗氧化肽及ACE抑制肽的结构各不相同,但分子量均小于1000 Da,肽段长度在5¹0,主要来源于β-CN,其次为α_s1-CN。与L.rhamnosus 1.0386相比,添加水解能力较强的L.helveticus 1.0614所获得的肽段较短。益生菌干酪抗氧化肽与ACE抑制肽在结构上具有一定相似性,即含有较多疏水性氨基酸和芳香族氨基酸,如抗氧化肽中含有Pro（P）、Tyr（Y）;ACE抑制肽的N端含有Val（V）、Ile（I）、Leu（L）,C端含有Val（V）、Ala（A）、Phe（F）或Pro（P）残基等,同时具有抗氧化性的肽段也可能具有ACE抑制活性。肽段活性高低取决于关键氨基酸的位置和肽链长短,一般肽链C-端为捕获自由基和ACE活性部位的结合位点。通常当肽链C-端为脯氨酸且肽段较短时则具有较高的抗氧化性和ACE抑制率。通过水解位点和活性肽的结构特征得出,益生菌的CEP是水解干酪产抗氧化肽和ACE抑制肽的关键蛋白酶,在成熟后期,氨肽酶也会促使干酪生成两种活性肽。