【摘 要】
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目的:大鼠肝脏3α-HSD[EC1.1.1.50]具有二氢二醇脱氢酶活性,利用该酶可对血清中的总胆汁酸含量进行检测.为获得3α-HSD高表达工程菌株,也为开发3α-HSD的临床应用提供资料,该
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目的:大鼠肝脏3α-HSD[EC1.1.1.50]具有二氢二醇脱氢酶活性,利用该酶可对血清中的总胆汁酸含量进行检测.为获得3α-HSD高表达工程菌株,也为开发3α-HSD的临床应用提供资料,该文对大鼠肝脏3α-HSD cDNA进行了克隆、表达及表达产物的纯化,并初步对纯化获得的重组3α-HSD的酶活性进行初步观察.结果与讨论:1、由于肝脏提取的总RNA有较好的完整性和较高的纯度,紫外分光光度法定量测得样品中RNA含量为2.88μg/μl.pGEM-T/33α-HSD序列分析发现克隆获得的3α-HSD与文献报道的仅一个碱基差别,在起始密码后的第814位T突变为C.2、不同诱导表达条件的探索表明,32℃、1mmol/L TPTG、4h为最佳条件,可获得高表达,表达的融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的37.9﹪.SDS-PAGE检测融合蛋白分子量约为42KD,与融合蛋白pET-30a-c(+)/3α-HSD的预期分子量相吻合.重组融合蛋白主要以可溶形式存在于表达菌的胞质中,采用亲和层析法使融合蛋白的分离纯化的过程简单易行.3、通过3α-HSD活性检测pET-30a-c(+)/3α-HSD融合蛋白的活性,已初步检测到菌体总可溶性蛋白和纯化后的融合蛋白均具有3α-HSD催化活性.
羟类固醇脱氢酶;克隆;表达;活性检测
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