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奶牛乳房炎主要是由病原藏生物侵入奶牛乳腺组织引起的炎症。该病发病率高、治愈难度大，导致牛奶产量减少、品质下降，是最终引发临床型乳房炎而导致奶牛淘汰、死亡的重要疫病之一。已报道引起奶牛乳房炎病原微生物主要为金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，由这三种病原引起的奶牛乳房炎约占该病发病总数的90％以上。目前，由大肠杆菌所引起的奶牛乳房炎逐渐增加，特别在发达国家，大肠杆菌性奶牛乳房炎发病率已达到2839％。我国由大肠杆菌引起的乳房炎的比例较高，如佛山地区大肠杆菌引起的奶牛乳房炎达50％，兰州地区大肠杆菌引起的奶牛乳房炎占24.44％,河南是养殖大省，奶牛的有栏量近几年急剧增加，而奶牛乳房炎的发生率也居高不下，导致奶牛的淘汰率上升，牛奶品质下降，严重影响着奶牛业的发展。 许多研究表明，细菌之间、细菌与宿主之间、细菌与环境之间具有密切联系。而密度感应(quorum sensing，QS)就是细菌中普遍存在的一种调控系统，该系统在同种细菌之间、异种细菌之间、细菌胞内及胞外的信息交流中发挥着十分重要的作用。LuxS/AI-2型密度感应系统均存在于革兰阴性菌和革兰阳性菌，可通过细菌产生的信号分子(Auto-inducer，AI)来协调细菌群体功能及调控细菌的质粒转移、生物被膜(biofilm)的形成、毒力基因的表达和细菌发光等。目前，研究细菌之间的信息交流已成为兽医微生物学研究的新热点。 大肠杆菌耐药性尤其是多重耐药的出现迫切需要采用新的方式来进行大肠杆菌引起的奶牛乳房炎病的防控。干扰或者阻断大肠杆菌的细菌密度感应系统，尤其是抑制LuxS/AI-2型密度感应系统，可以成为防控大肠杆菌导致的乳房炎的新途径。目前，对奶牛乳房炎大肠杆菌的AI-2信号分子对细菌的致病机制研究不多，本研究率先报道在奶牛乳房炎大肠杆菌中存在LuxS/AI-2型密度感应系统，通过以下两个方面对该系统进行了相关研究，以期为后续AI-2体外合成、AI-2对大肠杆菌的粘附性、毒力因子调控及研究抑制AI-2信号分子产生的新型药物等奠定坚实的基础。 1.奶牛乳房炎大肠杆菌AI-2信号分子检测 为了了解奶牛乳房炎大肠杆菌不同分离株产生AI-2(Autoinducer-2，AI-2)信号情况，探索不同的生长时期、不同培养条件对大肠杆菌AI-2产生的影响，检测信号分子AI-2的合成与luxS基因及pfs基因的转录水平间的相互关系。本实验以哈维弧菌BB170(vibrio harveyiBB170)为发光菌株，对来自奶牛乳房炎大肠杆菌的不同分离株E285、E80814、W41、E30707和EA701205菌株进行AI-2信号分子的检测，在此基础上以E285为检测菌株，分析大肠杆菌E285在不同生长时期与不同培养条件下AI-2活性情况，同时应用实时荧光定量PCR检测大肠杆菌E285在不同生长时期和不同培养条件下AI-2信号分子产生的与luxS基因与pfs基因转录水平的相关性。试验结果表明，奶牛乳房炎大肠杆菌不同分离株E285、E80814、W41、E30707和EA701205株均有AI-2信号分子产生，但产生的AI-2的量均低于阳性对照;对不同生长时期的AI-2活性检测结果表明，在迟缓期、对数前期E285的基本没有AI-2的表达，从对数中期开始大肠杆菌E285中的AI-2开始大量表达，到对数后期达到高峰，为阴性对照的12倍，随后下降，到稳定期已下降为阴性对照的3.6倍。不同培养条件分析结果显示，培养基中加入蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、NaC1及乳糖时，AI-2的活性与luxS基因转录水平均明显提高，两者具有一致性，其中加入乳糖后E285株的AI-2上调倍数最大。而AI-2的活性与pfs基因的转录水平没有明显的相关性。由此证明，奶牛乳房炎大肠杆菌分离株均能产生AI-2信号分子，其AI-2信号分子的产生与luxS基因转录水平具有高度的相关性，与pfs基因的转录水平无明显相关性;蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、NaCl及乳糖能够促进大肠杆菌E285产生AI-2信号分子。通过对LuxS/AI-2型密度感应系统的研究，为进一步研究该系统在奶牛乳房炎大肠杆菌中的作用打下坚实的基拙。 2.luxS和pfs基因克隆、表达及纯化 在细菌LuxS/AI-2型密度感应系统中，LuxS蛋白和Pfs蛋白是催化AI-2信号分子产生过程中的两个关键酶。为了了解编码LuxS蛋白不和Pfs蛋白的基因变异情况，获得重组LuxS和Pfs蛋白，本试验根据Genbank小luxS(YP-001199965)和pfs(NC-009443)公布的基因序列，针对luxS基因和pfs基因序列分别设计一对特异性引物，以大肠杆菌E285的DNA为模板，应用PCR扩增获得了luxS基因和pfs基因片段，纯化后分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后插入原核表达载休pET30a中，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析，将获得的重组质粒pET30a-luxS和pET30a-pfs转化BL21，经IPTG诱导，获得可溶性重组LuxS和Pfs蛋白，经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后分别免疫新西兰大白兔，制备的高免血清，利用western-blotting检测重组蛋白的免疫原性。试验结果表明，扩增获得的luxS基因和pfs基因高度保守，与Genbank中已发表的核苷酸序列同源性均达到98％以上，说明luxS基因和pfs基因奶牛乳房炎大肠杆菌中普遍存在，为高度保守的基因;且两基因在原核表达系统中能够高效表达可溶性重组蛋白，上清经纯化获得的重组LuxS蛋白和Pfs蛋白浓度分别为4.6mg/mL和5.3mg/mL;western blotting检测结果显示重组蛋白LuxS和Pfs具有良好的免疫原性。通过对luxS和pfs基因克隆、表达，为AI-2信号分子的体外合成提供技术支持。