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牙胚发育阶段摄入过量氟既可损伤牙釉质又可损伤牙本质。有关氟对牙釉质损伤机制的研究较多，部分机制已经明确。关于氟对牙本质作用的研究极少，其损伤机制尚不清楚。牙齿萌出牙釉质发育完成后，成牙本质细胞仍持续形成继发性牙本质，当受到外界龋病刺激时，还可形成反应性牙本质和修复性牙本质。故牙胚发育完成后，过量氟仍可能损害牙本质。目前，由于防龋摄入过量氟引起的牙齿氟中毒增加已日益被人们关注，一些局部使用的含氟防龋齿科材料对反应性牙本质、修复性牙本质有何影响还不能确定。研究氟对牙本质损伤机制将为进一步明确氟对牙齿损伤机制和合理用氟提供理论依据。 牙本质形成过程中，成牙本质细胞分泌有机基质(主要是Ⅰ型胶原)，基质蛋白酶对基质改建、降解，钙离子沉积形成矿化牙本质。氟对牙本质基质Ⅰ型胶原的影响还不清楚。金属蛋白酶-8(matrixmetalloproteinases，MMP-8)降解Ⅰ型胶原能力最强。以往认为MMP-8只能由多形核白细胞产生，近年发现，少数间充质来源的其他细胞也可表达MMP-8。MMP-8在牙胚发育中的表达和作用未见报道。钙离子转运是矿化组织必须的。牙本质矿化过程中，氟对成牙本质细胞钙离子转运的影响尚不清楚。本研究的目的是，明确过量氟对牙本质基质Ⅰ型胶原的影响；研究MMP-8在牙胚发育过程中的表达和过量氟对其表达和功能的影响，初步探讨过量氟对体外培养小鼠牙髓细胞内钙离子浓度和胞膜L钙离子通道蛋白表达的影响。 斡疆医科大沓傅士管位伦丈 研究内容和结果 1．过量氟对牙本质基质和牙乳头细胞合成分泌1型胶原影响 根据文献，制作大鼠氟中毒模型，采用免疫组织化学方法，研究过量氟对大鼠牙本质1型胶原的影响。结果发现，过量氟使成牙本质细胞内胶原聚集，牙本质基质I型胶原分布异常、排列紊乱，罩牙本质层和前期牙本质基质I型胶原浓染；对人牙乳头细胞体外培养，采用免疫细胞化学和图象分析半定量方法，观察氟对细胞合成I型胶原的影刃。结果发现，0．2 XIO－’g／L、1．0 XIO’g／L、5。0 XIO－’g／L、2 5x 10 ＼几浓度氟对体外培养的人牙乳头细胞合成 1型胶原量无明显影响。用 W e s t e r n hi o t 方法观察过量氟对人牙乳头细胞外基质 I型胶原的影响。结果表明，0．2／10－’g／乙、1．0＼IO‘g／L 5．OXIO’g／乙氟对细胞外 I型胶原量无影响，25X 10叫g几氟使 I型胶原条带加深，提示 25X 10叫g几浓度氟对细胞外工型胶原降解有抑制作用。 2．MMP叫在牙胚发育过程中的表达及氟对其表达和功能的影响 提取人牙胚组织总RNA，根据文献报道设计引物，用RT－PCR方法自5月胎龄人牙胚克隆到MMP－S 522bpCDNA片段，提示MMP－8参与了人牙胚发育；用免疫组织化学染色方法证实，人牙胚钟状期，MMP－8在成牙本质细胞、牙本质基质表达，说明牙本质形成过程中，成牙本质细胞可以合成MMP－8，MMP－8参与了牙胚发育过程牙本质基质改建：用原位杂交方法再次说明MMP－smRNA参与大鼠牙胚发育，并证实过量氟对大鼠牙胚发育过程 MMP－SmRNA水平无影响。0．ig／L MMP－S与 109 ＊可溶性I型胶原22’C共孵 育，体外观察0．Og／L、0．2 X IO‘g几、1．OXIO－’g／L、5．OXIO－’g几、25．OXIO－’g／卜125，OX10－’g八氟对M卜8酶活性的影响，蛋白凝胶电泳分析I型胶原降解产物，SDS－PAGE电泳图显示，Zh时间点，各组 I型胶原均发生不同程度降解，但 25 X 10－’g／L、125X 10－’g几氟浓度组 6 11－12二聚体和 al和 a 2单体条带色 一2—— 斩笆医科上沓仅士含佑铃久较深，即降解被部分抑制；sh时间点，各组胶原降解明显，不同氟浓度组间条带差别不明显，提示25 X 10叫g几和125X10叫g几氟对MMPE活性影响是可逆的。随时间延长，0～125 x 10－’g几氟对 MMP书活性无明显影响。 3．氟对小鼠牙髓细胞内钙离于浓度和细胞钙离子L－a ID通道蛋白的影响 用第3 代荧光染料荷载小鼠牙髓细胞，利用激光共聚焦显微镜（Laser scann。us contocal microscope，LSCM）技术观察过量氟对小鼠牙髓细胞内 Ca卜影响的动态变化，结果发现，259 10仆g几氟可以使细胞内Ca’“荧光强度迅速升高。提示过量氟使细胞基质Ca’”需求量增加，导致细胞内钙库迅速释放Ca’“。用免疫细胞化学方法观察过量氟对小鼠牙髓成纤维细胞卜。ID通道蛋白的影响，结果发现氟对其蛋白合成无明显影响。过量氟对细胞Ca卜转运机制的影响尚待进一步研究。 结 论 过量氟可以造成牙本质基质I型胶原排列异常，抑制细胞外1型胶原降解，这可能是氟对牙本质损伤机制之一。MMP－8 参与了牙胚发育钟状期牙本质基质改建，过量氟对MMP－smRNA表达无明显影响，在体外，25X10－’g／L禾 125X10‘g／L氟对MMP－8降解1型胶原活性有暂时抑制作用。过量氟可引起小鼠牙髓细胞钙库释放Ca’