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猪流行性腹泻病毒是造成仔猪高发病率和高死亡率的一种肠道致病性冠状病毒,具有重要的经济意义。引起的以水样腹泻、呕吐和脱水为特征,各种年龄和不同品种的猪群都有易感性的一种急性高度接触性的猪肠道传染病。PABPC4(cytoplasmic poly(A)binding protein 4)是一种mRNA结合蛋白,在红细胞分化、端粒酶活性调节和细胞生长中起重要作用。N蛋白是RNA结合蛋白,参与转录、翻译和病毒组装。实验室前期通过质谱分析发现PABPC4与PEDV N蛋白互作。为进一步探究PABPC4对冠状病毒复制的影响,我们进行了以下研究:1.SP1调控PABPC4的表达。通过PABPC4启动子扩增、双荧光素酶试验和荧光定量PCR等试验,结果表明:SP1为PABPC4的转录因子。2.PABPC4抑制PEDV复制并通过PABPC4-MARCH8-NDP52自噬途径降解PEDV N蛋白。第一,在Vero和LLC-PK1细胞上,过表达和干扰PABPC4并感染PEDV。试验结果表明:PABPC4在Vero细胞和LLC-PK1细胞上能够抑制PEDV复制。第二,通过Co-IP、激光共聚焦和GST Pull Down试验,结果显示:PABPC4与PEDV N蛋白存在相互作用。第三,将PABPC4与PEDV N蛋白共转293T细胞。试验结果表明:PABPC4梯度降解PEDV N蛋白且N蛋白的降解对PABPC4呈剂量依赖性。这些数据表明PABPC4参与调控PEDV N蛋白的水平。第四,将N蛋白的质粒与PABPC4共转染到HEK 293T细胞中,并对细胞进行加入蛋白酶体抑制和自噬抑制剂处理。结果显示:N蛋白的降解可能是通过自噬-溶酶体途径介导的。第五,将PABPC4与PEDV N蛋白共转293T细胞。Western blot试验结果显示:PABPC4与N蛋白共表达可提高HEK 293T细胞自噬水平。第六,为了检测PABPC4是否通过将MARCH8和NDP52引入N蛋白而介导N蛋白的泛素化。Co-IP数据表明:PABPC4通过使PEDV N蛋白和MARCH8与货物受体NDP52结合,将其定向于自噬降解。第七,我们用质粒编码PEDV的HA-N蛋白和FLAG-PABPC4,以及小干扰RNA(NDP52、MARCH8、ATG5或NC siRNA)进行转染HEK 293T细胞。试验结果表明:PEDV的N蛋白通过PABPC4-MARCH8-NDP52自噬途径被自噬降解。3.PABPC4抑制冠状病毒复制并通过PABPC4-MARCH8-NDP52自噬途径广泛降解Co V N蛋白。第一,通过Co-IP试验验证PABPC4与不同类型冠状病毒N蛋白是否存在相互作用。试验结果显示:PABPC4与不同类型冠状病毒N蛋白之间相互作用。第二,将PABPC4与CoV N蛋白共转293T细胞。结果表明:PABPC4参与了CoV N蛋白水平的调控。第三,将SARS-CoV-2 N蛋白的质粒与PABPC4共转染到HEK 293T细胞中,并对细胞进行加入蛋白酶体抑制和自噬抑制剂处理。结果显示:SARS-CoV-2 N蛋白的降解可能是通过自噬-溶酶体途径介导的。第四,我们用质粒编码CoV的HA-N蛋白和FLAG-PABPC4,以及小干扰RNA(NDP52、MARCH8、ATG5或NC siRNA)进行转染293T细胞。结果表明:PABPC4-MARCH8-NDP52自噬体途径广泛参与Co V的降解。第五,为了研究PABPC4是否在病毒感染过程中调节Co V N蛋白水平,我们将细胞转染PABPC4-Flag,然后用不同病毒属的CoVs进行感染。试验结果显示:PABPC4对这三种不同类型冠状病毒均有显著的抑制作用。综上所述,本研究证明了SP1为PABPC4的转录因子,直接参与调控PABPC4的表达。还证实了宿主蛋白PABPC4通过PABPC4-MARCH8-NDP52自噬体途径抑制CoV复制,这表明了PABPC4对不同冠状病毒具有广谱的抑制作用,且PABPC4-MARCH8-NDP52自噬体途径广泛参与CoV的降解。这不仅为开发防控冠状病毒的药物提供了理论基础,也进一步解析了宿主拮抗冠状病毒复制的新机制。