【摘 要】
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【目的】构建p33及NLS肽段重组真核融合蛋白表达质粒pcDNA3.1-p33-V5-His及pcDNA3.1-NLS-V5-His，观察重组质粒表达蛋白的亚细胞定位及目的基因表达蛋白对胶质母细胞瘤细胞增殖的作用和对凋亡的促进作用。【方法】应用反转录PCR(reverse transcript PCR，RT-PCR)的方法从人胚肺纤维母细胞系MRC-5中扩增p33的cDNA编码区，并将其亚克隆至载
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【目的】
构建p33及NLS肽段重组真核融合蛋白表达质粒pcDNA3.1-p33-V5-His及pcDNA3.1-NLS-V5-His，观察重组质粒表达蛋白的亚细胞定位及目的基因表达蛋白对胶质母细胞瘤细胞增殖的作用和对凋亡的促进作用。
【方法】
应用反转录PCR(reverse transcript PCR，RT-PCR)的方法从人胚肺纤维母细胞系MRC-5中扩增p33的cDNA编码区，并将其亚克隆至载体pBS-T中，构建成重组质粒pBS-T-p33；酶切纯化编码p33的DNA片段，将其插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His的多克隆位点，构建pcDNA3.1-p33-V5-His重组真核融合蛋白表达质粒。将p33的NLS编码区插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His，获得真核融合蛋白表达质粒pcDNA3.1-NLS-V5-His。将两个重组质粒及空载体分别转染TJ905细胞，经过G418筛选出稳定表达外源性基因的细胞系。通过免疫组织化学染色法确定外源性蛋白的亚细胞定位，并分别通过Ki-67免疫组织化学染色法、细胞集落形成实验、流式细胞仪检测及碱性单细胞凝胶电泳在TJ905细胞系中观察上述外源性蛋白抑制细胞增殖及促进细胞凋亡的作用。
【结果】
琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定结果显示所得p33的cDNA编码区分子量大小与理论值相符，序列完整，无突变存在。对重组真核融合蛋白表达质粒pcDNA3.1-p33-V5-His，pcDNA3.1-NLs-V5-His的DNA序列测定显示插入目的基因碱基序列及读码框均完全正确。免疫组织化学染色法显示两重组质粒表达蛋白定位于细胞核。与TJ905对照组，空载体组相比较，在细胞集落形成实质粒pcDNA3.1-NLS-V5-His细胞组，pcDNA3.1-p33-V5-His细胞组细胞凋亡均明显高于对照组和空载体组(P<0.001)。
【结论】
通过本研究证实了(1)正常情况下p33应定位于细胞核中，其正常的亚细胞定位是发挥生理作用的重要前提。(2)NLS序列是p33入核的关键序列，它可以介导重组质粒进入细胞核，且在NLS序列周围可能存在与DNA结合并促进具有异常DNA的细胞发生凋亡的功能区。(3)p33中第171至196个氨基酸残基可能为p33羧基端转录静息功能的重要结构。(4)转染外源性p33可有效抑制TJ905胶质母细胞瘤细胞系的增殖并促进细胞发生凋亡。
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