鹅γ-干扰素表达及抗病毒活性的研究

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鹅γ-干扰素(IFN-γ)是由激活的T细胞和NK细胞产生的一类细胞因子,它具有高效的抗病毒感染作用,作为生物药剂具有广阔的应用前景。本研究从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因,并将其克隆、测序,结果得到495 bp片段,与Genbank上已公布的鹅的IFN-γ核苷酸序列进行比较,其同源性均在99.2%以上,氨基酸同源性高于98.2%。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到质粒pGEX-6P-1-IFN-γ,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导4h,裂解菌体作SDS-PAGE分析,得到约43 KD融合表达蛋白特异条带,用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。同时构建pcDNA3.1(+)-IFN-γ真核表达质粒,经测序鉴定后,在室温条件下,质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ浓度20μg/mL,BHK21细胞密度106个/mL,电穿孔仪参数设为425 V电压、25μF电容、连续脉冲2次,用400μL转化体积转染BHK21细胞,待细胞贴壁后经过浓度为600μg/mL的G418连续筛选14天后,出现抗性细胞克隆,将阳性BHK21细胞上清液进行Western-blot鉴定,检测结果证明鹅IFN-μ在BHK21细胞中得到表达。最后,用1OOTCID50病毒量在鹅副粘病毒/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现原核表达蛋白稀释倍数小于104和真核表达蛋白稀释倍数小于105均可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算原核和真核表达的鹅IFN-γ抗病毒效价分别为2.0×103U/mL和1.3×104U/mL,表明原核和真核表达蛋白都具有良好的抗病毒活性。
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