论文部分内容阅读
电纺纤维技术作为一种新型的材料加工方法,可以得到直径在纳米到微米级的超细纤维膜。纤维膜具有较高的孔隙率、极大的比表面积、良好的结构仿生性,有利于细胞的粘附和药物的携载和释放。本论文旨在构建一种新型携载基因的聚合物超细纤维制剂,系统研究基因的携载和释放,电纺和释放过程中基因的结构完整性和转染活性的保持等。本文首先是模型基因的提取和纯化。通过CaCl2法制备E.coli DH5a的感受细胞,将pECFP-N2质粒转化感受细胞,构建了含pECFP-N2质粒的E.coli DH5a转化子。经大量培养扩增后,利用试剂盒提取纯化pECFP-N2质粒。经过紫外光谱、凝胶电泳检测,得到的质粒与原质粒结构相符、纯度较高。采用乳液电纺的方法,成功地将质粒DNA载到聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)中,得到DNA/PELA纤维。纤维形貌规整,直径为450±140 nm,激光共聚焦扫描电镜观察表明荧光标记质粒包裹于纤维内部,形成了明显的核壳结构。质粒的实际包裹效率达到了92.7%,从纤维中萃取的质粒经琼脂糖凝胶电泳检测表明结构完整,细胞转染实验表明质粒活性良好,表明电纺过程较好地保护了质粒的结构和活性。体外释放显示出一个缓慢、稳定的释放特性,在12h仅释放了29.1%,维持了将近35天的缓慢释放,表明了核壳结构的纤维在减少突释、保持持续释放等方面的作用。电泳检测结果表明核壳纤维在释放过程中保持了完整的结构,细胞转染实验证明了保持了较好的转染效率,这进一步证明了核壳结构纤维对质粒的保护作用。在乳液电纺中,分别在油相和水相中引入聚乙烯亚胺(PEI),制备了DNA/PELA-PEI和DNA-PEI/PELA核壳结构纤维。体外释放结果表明,DNA/PELA-PEI和DNA/PELA纤维的释放行为相近,都能很好地控制DNA的释放。但DNA-PEI/PELA除了早期的突释外,DNA-PEI复合粒子难于释放出来。在细胞的粘附和增殖试验中,DNA/PELA-PEI纤维中PEI的加入一定程度上改变了纤维的亲水性,但是随着其含量的增加也加大了对细胞的毒性。而DNA-PEI/PELA纤维中,复合粒子的突释导致培养初期对细胞的毒性。在纤维支架上的细胞转染实验结果表明,在纤维核层或壳层中引入PEI有助于质粒对细胞的转染,转染效率与加入的PEI量有关。本文利用乳液电纺成功将质粒载到核壳结构的超细纤维中,在电纺和释放过程中较好地保持了基因的结构完整性和转染活性。本研究不但对药物控释体系和组织工程的研究有一定的借鉴意义,也为基因治疗提供了新的思路。