论文部分内容阅读
目的肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，是肿瘤持续生长的根源。研究发现胃癌中存在胃癌干细胞（gastric cancer stem cells,GCSCs）。本研究的目的在于利用免疫磁珠分选技术(magnetic cell sorting,MACS)分选出CD44(+)AGS细胞，并从细胞增殖、肿瘤球形成、分化、耐药性、侵袭迁移及体内致瘤能力等方面，阐明CD44(+)AGS细胞的GCSCs样生物学特性；探讨二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）对CD44(+)AGS细胞生长的抑制作用及对细胞周期的影响，为阐明DADS抗胃癌作用提供重要实验依据。方法MACS技术分选人胃癌AGS细胞中的CD44(+)AGS细胞亚群，流式细胞术检测分选的效率和细胞周期分布；肿瘤球形成实验观察CD44(+)细胞的增殖能力；免疫荧光检测CD44(+)细胞亚群的肿瘤球的分化情况；MTT实验检测CD44(+)和CD44(-)AGS细胞亚群对化疗药物氟尿嘧啶和依托泊苷的敏感性；采用迁移侵袭实验鉴定CD44(+)和CD44(-)AGS细胞亚群迁移侵袭能力；裸鼠体内成瘤实验分析两个亚群细胞在裸鼠体内的致瘤性；MTT法观察DADS对AGS细胞增殖的影响；流式细胞术、软琼脂集落形成实验等方法，研究DADS对CD44(+)AGS细胞的增殖、细胞周期的影响。结果1.流式细胞术结果表明，在AGS人胃癌细胞系中大约有2.8%的CD44(+)AGS细胞，通过免疫磁珠术分选后，CD44(+)AGS细胞的细胞中CD44阳性率高达99.9%，而CD44(-)AGS细胞的CD44(+)亚群细胞百分比只有0.3%；2.肿瘤球形成实验发现，分选后的CD44(+)AGS细胞接种到无血清培养基中，2周后即形成典型的肿瘤球，其肿瘤球形成率可达74.3%；而CD44(-)AGS细胞不具有形成肿瘤球能力；3.流式细胞术显示，CD44(+)AGS细胞的增殖率为59.6%，CD44(-)AGS细胞的细胞增殖率为28.3%；免疫荧光观察显示，CD44(+)AGS细胞可清晰地观察到胞膜上的绿色荧光，而CD44(-)AGS细胞只有个别细胞有弱绿色荧光，阳性表达率极低；4.分化实验显示，肿瘤球细胞在含血清培养基中贴壁生长，胞质向外伸出突起，CD44荧光表达明显减弱，迁移出的细胞包膜上无绿色荧光，在无血清培养基中肿瘤球细胞CD44表达明显，细胞膜上有较强绿色荧光；5.耐药实验结果表明：倒置显微镜下可见，CD44(-)AGS细胞在化疗药物作用下细胞数减少明显多于CD44(+)AGS细胞；MTT结果显示，CD44(-)AGS细胞对化疗药物5-FU和VP-16的敏感性明显高于CD44(+)AGS细胞；6.侵袭转移实验结果表明，转移及侵袭至微孔膜下层的CD44(+)AGS细胞均比CD44(-)AGS细胞多；7.裸鼠成瘤实验显示，CD44(+)AGS细胞中2×103个细胞组未成瘤，2×104个细胞组成瘤率为75%，2×105个细胞组成瘤率100%，且瘤体较大，而CD44(-)AGS细胞各组均无裸鼠成瘤；8. DADS对CD44(+)AGS细胞抑制作用实验中，软琼脂集落实验显示DADS可呈浓度依赖性抑制CD44(+)AGS细胞增殖，流式细胞仪检测经DADS处理后的CD44(+)AGS细胞周期阻滞于G2/M期，且呈浓度和时间依赖性。结论1. CD44（+）AGS细胞具有胃癌干细胞样生物学特性。2. DADS可抑制CD44（+）AGS细胞增殖，其机制与阻滞细胞周期于G2/M期有关。