【摘 要】
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核酸是生物体中重要的遗传物质,在生命活动中发挥许多重要作用。除了双螺旋DNA结构外,核酸还具有三链、交叉十字链、G-四链体等非典型的各种高级结构。这些结构在调节细胞活动中具有某些独特的功能,但大多数与这类非典型核酸结构相关的生物机制尚未完全了解。因此,在体内实时识别任何高阶的DNA结构,如G-四链体DNA,通过监测它们的结构动力学和研究它们在活细胞中的生物活性是一项具有挑战性的任务。人类端粒末端存
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核酸是生物体中重要的遗传物质,在生命活动中发挥许多重要作用。除了双螺旋DNA结构外,核酸还具有三链、交叉十字链、G-四链体等非典型的各种高级结构。这些结构在调节细胞活动中具有某些独特的功能,但大多数与这类非典型核酸结构相关的生物机制尚未完全了解。因此,在体内实时识别任何高阶的DNA结构,如G-四链体DNA,通过监测它们的结构动力学和研究它们在活细胞中的生物活性是一项具有挑战性的任务。人类端粒末端存在G-四链体形成序列,稳定端粒G-四链体结构的形成会导致端粒酶活性降低,而端粒酶在肿瘤细胞中高度表达,是其永生化的主要调控蛋白。c-MYC癌蛋白参与了细胞周期、细胞凋亡等许多生理过程的调控,在其启动子区域发现的c-MYC G-四链体DNA能控制c-MYC癌蛋白的表达,有望成为潜在药物靶点。目前针对这两个G-四链体结构开发了大量配体,在抗肿瘤细胞增殖和调控机理研究上取得了一定的进展。然而,这些配体仍然存在特异性不足、成药性差、膜通透性差、摄取能力不足、不能对G-四链体DNA进行实时示踪等缺点。基于此背景,本文开发了系列噻唑橙衍生物,并从光谱学,生物化学和分子生物学等方法详细的探索了其与端粒/c-MYC G-四链体结构之间的相互作用能力、荧光实时示踪能力及抗肿瘤机理研究。本论文研究内容包括:(1)研究了噻唑橙衍生物A1~A10和B1~B4对各类核酸的荧光识别性能;(2)运用CD光谱、CD熔点、紫外光谱和等温量热滴定法等手段研究A3、B2和B3与各类核酸的结合能力;(3)利用~1H MNR滴定、单位点突变核酸的荧光变化等手段研究A3与端粒G-四链体DNA的结合模式;(4)在体外和细胞中研究了A3示踪和稳定端粒G-四链体DNA的能力;(5)运用MTT研究A3对各类细胞的毒性作用;(6)运用q RT-PCR技术研究A3对端粒酶相关基因转录水平的影响;(7)研究A3对癌细胞中端粒酶活性、端粒长度和衰老的影响;(8)运用~1H MNR滴定和计算机分子模拟技术研究B2和B3与端粒/c-MYC G-四链体DNA的结合模式;(9)研究B2和B3在细胞内选择性示踪G-四链体DNA的能力;(10)运用MTT研究B2和B3对各类细胞的毒性作用;(11)运用q RT-PCR技术研究B2和B3对癌细胞中c-MYC和端粒酶相关基因转录水平的影响;(12)运用Western Blot技术研究B2和B3对c-MYC、端粒酶、凋亡通路和DNA损伤通路相关蛋白表达的影响;(13)在外显子特异性实验中,研究了B2和B3对c-MYC G-四链体结构的稳定能力与c-MYC基因转录之间的影响;(14)在小鼠体内研究B2和B3对肿瘤活性的抑制效果;(15)运用LS-MS技术探究了B2和B3在动物体内的血药代谢情况;(16)研究B3对动物体内肿瘤的靶向示踪能力。研究结果表明衍生物A3对端粒G-四链体DNA具有高度特异性和优秀的结合能力,主要通过π-π末端堆积和5’端附近侧环相互作用结合。A3荧光稳定性好,能在活细胞内特异性识别和成像端粒G-四链体DNA,能够下调h TERC和h TERT等对端粒酶活性有关键调控作用的基因的转录,使得癌细胞中端粒功能发生障碍,端粒酶活性降低,诱导癌细胞衰老和凋亡。在评价配体的抗癌活性时,A3对多种癌细胞具有明显高于正常细胞的毒性。除此之外,研究结果表明衍生物B2和B3的结构差异(取代基二甲胺基换为二苯胺基)会导致对不同G-四链体的选择性,其中B2对端粒G-四链体结构具有选择性,B3对c-MYC G-四链体结构具有选择性。进一步研究发现B3除了和B2同样通过π-π堆积作用和G-四分体5’端附近的侧环氢键有相互作用外,B3结构末端的非极性二苯胺取代基可能在c-MYC G-四链体DNA结构的选择性识别中发挥关键作用。这两个配体在活细胞内都对G-四链体DNA具有特异性的荧光识别信号。此外,B2和B3具有较高的癌细胞毒性,均能下调癌细胞中c-MYC、h TERT和h TERC基因的表达,其中B2对h TERT表达有最显著的下调作用。而B3对c-MYC表达有最显著的下调作用,且对h TERT表达的影响相对较弱。B2和B3能够诱导癌细胞的急性细胞衰老和凋亡,可能是由于c-MYC表达和端粒酶活性被抑制,从而导致癌细胞的端粒功能障碍、诱导DNA损伤积累和增殖阻滞。外显子特异性实验验证了B3通过稳定c-MYC G-四链体DNA来抑制c-MYC基因的转录。动物实验显示B3的抗肿瘤活性优于B2,药代动力学研究表明B3在动物体内有更好的留存效应,这可能是B3具有更好抑制肿瘤生长能力的一个重要原因。综上所述,这些结果可能为高特异性靶向G-四链体结构的抗癌药物设计提供有意义的见解。
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