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背景与目的:恶性肿瘤对生命的最大威胁就是其具有远处转移的能力。目前已经证明肿瘤脉管生成与肿瘤转移密切相关，而血管内皮生长因子A(VEGF-A)和血管内皮生长因子C(VEGF-C)是血管内皮生长因子家族(VEGFs)中最重要的两种因子。其中VEGF-A主要在肿瘤血管生成过程中发挥重要作用。而VEGF-C能促进肿瘤淋巴管生成，促进肿瘤细胞向区域淋巴结转移，且在肿瘤血管生成中与VEGF-A具有协同促进效应。我们以前的研究表明[1]，VEGF-A及VEGF-C在人乳腺癌组织中均呈高表达(85.7％、90.8％)，VEGF-A及VEGF-C表达与淋巴结转移密切相关。鉴于VEGF-A、VEGF-C在肿瘤间质血管、淋巴管生成中具有协同促进效应，是最重要的促进肿瘤间质脉管生成因子，因此，同时阻断这两种因子的表达，可望更有效地抑制肿瘤血管和淋巴管的生成，从而抑制肿瘤生长和转移。
反义脱氧寡核苷酸(ASODN)是人工合成的DNA片段，它与体内某信使核糖核酸(mRNA)或脱氧核糖核酸(DNA)具有互补序列，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而阻断基因表达。因ASODN具有高效、低毒、特异性强、定位准确等优点，已被逐渐开发成为一种新型的抗癌药物，ASODN作为一种药物真正走向临床已为期不远。目前，国内外尚未见到利用反义脱氧寡核苷酸技术同时拮抗乳腺癌中VEGFS功能的报道。应用原位移植(OrthotopicTransplantation)方法建立的乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型移植成功率高，移植瘤生物学行为和药物动力学更接近于人体的原发瘤。因此，此模型成为研究肿瘤脉管生成、肿瘤生长转移及治疗的一个很好材料。结合以上的研究背景，并根据VEGF家族成员具有部分结构同源序列的特点，我们应用可同时封闭VEGF-A、VEGF-C基因表达的ASODN片段，通过体外实验，观察该片段对乳腺癌MCF-7细胞VEGF-A和VEGF-C基因表达的抑制作用；并在乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型中观察其对脉管生成及对肿瘤生长转移的影响；为开发同时封闭VEGF-A、VEGF-C基因表达的反义药物奠定实验理论基础。
方法一、用脂质体(LipofectamineTM2000)介导ASODN转染MCF-7细胞，荧光倒置显微镜观察FITC荧光标记的ASODN转染率随时间变化的情况。
二、1uM的ASODN、错义脱氧寡核苷酸(MSODN)和单纯脂质体分别与MCF-7细胞共培养48h，四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT)法检测MCF-7细胞生长情况。
三、1uMASODN与MCF-7细胞共培养12、24、48、72h后，RT-PCR法检测VEGF-A和VEGF-CmRNA的表达情况。
四、建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，设立对照组、错义组和反义组。
五、体内观察ASODN对裸鼠移植瘤VEGF-A和VEGF-CmRNA(RT-PCR)及蛋白表达(免疫组化)的影响。
六、彩色多普勒能量图(CDE)检测裸鼠移植瘤内血管丰度。
七、5单腺苷酸酶－碱性磷酸酶(5-Nase-ALPase)双重酶组织化学法标记微血管和微淋巴管，并计数微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(LMVD)。
八、观察ASODN对裸鼠移植瘤成瘤时间、生长速度、肿瘤体积、重量及对肿瘤浸润转移的影响。
结果一、LipofectamineTM2000介导转染MCF-7细胞：1uMASODN转染6h后转染率可达86％，48h转染率为29％。
二、反义组(1uM)作用48h可显著抑制MCF-7细胞的生长(P＜0.01)，而脂质体和MSODN对MCF-7细胞生长无影响(P＞0.05)。
三、1uMASODN转染12h，可见MCF-7细胞VEGF-A和VEGF-CmRNA表达下降幅度最大。此后，随着转染时间的延长，作用效果逐渐减弱，至48h后，其抑制作用基本消失。
四、将乳腺癌MCF-7细胞原位移植到裸鼠乳腺脂肪垫，各组在接种MCF-7细胞后接种部位出现肿块，接种成功率为100％，部分荷瘤鼠可发生远处转移。
五、ASODN能抑制裸鼠移植瘤VEGF-A和VEGF-CmRNA及蛋白表达(P＜0.01)；而MSODN对VEGF-A和VEGF-C表达无明显抑制作用(P＞0.05)。
六、CDE检测结果显示：对照组(83.3％)及错义组(75.0％)以Ⅱ型、Ⅲ型血流信号为主；而反义组CDE血流信号多为0型、Ⅰ型(共占66.7％)。
七、5-Nase-ALPase双重酶组织化学法示微血管呈蓝色，微淋巴管呈棕色。计数MVD与LMVD，结果显示：ASODN对血管和淋巴管生成均有抑制作用(P＜0.05)，而MSODN对血管和淋巴管生成均无明显抑制作用(P＞0.05)。
八、反义组肿瘤生长速度较对照组及错义组缓慢，且肿瘤重量和体积明显低于对照组(P＜0.05)；另外，ASODN能从直接蔓延、淋巴道转移、血道转移及种植性转移这几方面抑制肿瘤的扩散。
结论一、应用同时封闭VEGF-A、VEGF-C基因表达的ASODN片段，体外实验证明该片段可显著下调MCF-7细胞VEGF-A和VEGF-CmRNA的表达；并在一定程度上抑制了MCF-7细胞的增殖。
二、原位移植方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，移植成功率高，部分荷瘤鼠可发生远处转移，移植瘤生物学行为接近于人类原发乳腺癌。
三、体内实验证实，此ASODN片段同样可显著下调移植瘤VEGF-A和VEGF-CmRNA及蛋白表达，进而抑制移植瘤血管和淋巴管生成。
四、ASODN通过抑制移植瘤血管和淋巴管生成，达到了抑制肿瘤生长、浸润和转移的目的。该ASODN片段在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。