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目的糖尿病肾病是世界范围内最常见的终末期肾病及肾脏代替治疗的病因之一。目前相关研究认为肾素血管紧张素系统（RAS）抑制剂是减少DKD患者发展为终末期肾脏病风险的标准治疗。同时内皮功能紊乱及血液流变学改变与糖尿病肾病的发生发展密切相关。本研究旨在通过STZ诱导的糖尿病肾病大鼠阳虚血瘀证动物模型,以RAS系统关键因子、内皮系统关键因子、血液流变学及肾脏病理等指标为切入点,探讨“肾虚证”与RAS系统,“肾络微型癥瘕”与内皮系统损伤标志物及血流流变学的关系,为中医肾病“虚损劳衰”、“肾络微型癥瘕”病理假说及散结消聚治法提供分子研究基础。通过对比不同组别大鼠治疗后相关指标变化情况,验证总结益气温肾散结法及其代表方止消温肾宁颗粒治疗DKD的作用机理,分子机制、作用靶点及作用时机。方法1.糖尿病肾病大鼠动物模型的证型评价采用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）单次腹腔内注射的方法,构建糖尿病肾病大鼠动物模型,分别于成膜后6w、10w、12w、16w进行实验。①收集模型大鼠24h尿液,检测24h尿蛋白、尿肌酐;②收集腹主动脉血,检测肾功能,石蜡包埋、切片HE,PAS,Masson染色,观察肾组织病理改变;③收集腹主动脉血,对模型大鼠阳虚证相关指标进行评价:血液中环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、促肾上腺皮质激素（ACTH）等含量的变化。2.观察模型大鼠肾脏ACE-AngⅡ-AT1R和ACE2-Ang（1-7）-Mas两条轴关键因子的变化规律及肾脏血流动力学的改变。采用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）单次腹腔内注射的方法,构建糖尿病肾病大鼠动物模型,根据实验一中证候评价结果,选取阳虚证模型大鼠进行实验。①收集模型大鼠24h尿液,检测24h尿蛋白、尿肌酐;②收集腹主动脉血,检测肾功能,石蜡包埋、切片HE,PAS,Masson染色,观察肾组织病理改变;③Westerton-blots检测、RT-PCR技术检测大鼠肾皮质中ACE-Ang Ⅱ-AT1R和ACE2-Ang（1-7）-Mas通路关键因子ACE2、ACE、AT1、Mas mRNA及蛋白的表达,ELISA法检测肾脏组织内REN（肾素）、Ang Ⅰ、AngⅡ含量的变化。④大鼠血脂、血浆纤维连接蛋白（fibronectin,FN）含量检测,血管性假性血友病因子（vWF）表达水平、及肾脏组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA的表达。⑤统计学分析各相关指标之间的相关性。3.给予益气温肾散结中药进行治疗,以药测证,进一步验证假说。采用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）单次腹腔内注射的方法,构建糖尿病肾病大鼠动物模型,根据实验一中证候评价结果,选取阳虚证模型大鼠进行实验。将实验大鼠分为正常组,阳虚证模型组,缬沙坦组,益气温肾散结中药组（低、中、高剂量）。给药8周后,①收集模型大鼠24h尿液,检测24h尿蛋白、尿肌酐;②收集腹主动脉血,检测肾功能,石蜡包埋、切片HE,PAS,Masso染色,观察肾组织病理改变;③Westerton-blots 检测、RT-PCR技术检测大鼠肾皮质中ACE-Ang Ⅱ-AT1R和ACE2-Ang（1-7）-Mas通路关键因子ACE2、ACE、AT1、Mas mRNA及蛋白的表达,ELISA法检测肾脏组织内REN（肾素）、Ang Ⅰ、AngⅡ含量的变化。④大鼠血脂、血浆纤维连接蛋白（fibronectin,FN）含量检测,血管性假性血友病因子（vWF）表达水平、及肾脏组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA的表达。成果实验一1.课题组通过STZ造模成功后,模型组空腹血糖水平较正常对照组显著上升,并稳定在相对高水平阶段（P＜0.001,具有极显著性统计学差异）;模型组大鼠ACR水平在第10周及12周左右出现明显的变化,达到糖尿病肾病的诊断标准。2.实验过程中各个时间段的模型组大鼠血清中TG、TC水平较对照组均有显著上升的趋势（P＜0.05）。3.动物实验过程中对糖尿病肾病大鼠模型进行阳虚证证侯评价发现:其阳虚证相关指标（cAMP、cGMP、T3、T4、ACTH等）在第10周至12周阶段会出现较为明显的降低。4.模型组大鼠肾脏病理切片第6周时间段出现早期肾脏病变,如基底膜的轻度增厚,系膜基质的扩张;至12周阶段,上述病变加重,同时伴有肾小管官腔狭窄等病理改变。实验二1.糖尿病大鼠造模成功后,除对照组外各组血糖水准保持在较高状态（P＜0.05）,未出现回落情况。2.与正常对照组比较,其余各组大鼠ACR水平升高极其显著（P＜0.001）,表明STZ造模后各组均达到糖尿病肾病的标准要求。3.通过凝血相关指标分析,中药组（以中剂量组显著）FN水平较西药组及模型组相对偏低（P＜0.05）;中药组及西药组vWF水平明显低于模型组（P＜0.05）,而中药组vWF水平显著低于西药组（P＜0.05）,其中以中药中剂量组最为明显。4.通过不同实验组大鼠阳虚证证侯评价发现:（1）不同浓度中药组cAMP指标水平较模型组及西药组偏高,与西药组比较存在显著差异（P＜0.05）;（2）西药组及中药高剂量组cGMP指标明显高于模型组,而中药高剂量组结果普遍高于其他治疗组（P＜0.05）;（3）T3指标不同治疗组与对照组比较均偏低,而中药组较西药组及模型组显著偏高（以中药中高剂量较为显著,P＜0.05）;（4）T4指标模型组与西药组明显低于对照组、中药低剂量组、中药中剂量组及中药高剂量组（P＜0.05）;（5）ACTH指标对照组与其余组比较P＜0.05,治疗组较模型组比较有所上升趋势,其中中药高剂量组比较显著（P＜0.05）。5.通过对各组RAS关键因子比较发现:REN指标模型组显著高于其他组（P＜0.05）,治疗组中中药组REN水平低于西药组（P＜0.05）,中药组中以中药高剂量组最为明显;中药治疗组Ang Ⅰ、AngⅡ指标较模型组及西药组均有所改善（P＜0.05）。6.通关各组相关基因表达水平分析发现:（1）ACE2基因表达指标中药组较西药组及模型组有差异（P＜0.05）;（2）ACE基因表达指标中药低剂量、中剂量及高剂量组与模型组、西药组比较有差异（P＜0.05）;（3）AT1基因表达指标中药组明显低于模型组及西药组（P＜0.05）;（4）Mas基因表达指标中药组及对照组均高于其他几组（P＜0.05）,中药组与对照组较为接近;（5）t-PA基因表达指标对照组及中药组较模型组、西药组相比偏高（P＜0.05）;（6）PAI-1基因表达指标模型组及西药组显著高于其他组（P＜0.05）。结论实验一STZ能成功诱导糖尿病肾病模型,在一定时间后出现“三多一少”症状,血糖及ACR水平的显著提高,糖尿病肾病早期的病理改变。通过不同时间段对比,其阳虚证相关指标（cAMP、cAMP、T3、T4、ACTH等）在第10周至12周阶段会出现较为明显的降低,结合肾脏病理切片初步确定糖尿病肾病大鼠动物模型的阳虚证型时间点为成膜后12周左右。实验二通过对比各实验组相关指标数据可知,糖尿病肾病模型会出现明显的糖代谢、脂代谢异常,引起血液流变学的改变。此外,模型组较对照组会出现阳虚证相关指标（cAMP、cGMP、T3、T4、ACTH）变化,肾虚证相关的RAS系统ACE2-Ang（1-7）-Mas与ACE-AngⅡ-AT1功能轴动态失衡,从而促进糖尿病的发生发展。本课题实验研究发现益气温阳散结组方能在一定程度上改善cAMP、cGMP、T3、T4、ACTH阳虚证指标,减轻阳虚证,以中高剂量中药组尤为显著。同时增强ACE2-Ang（1-7）-Mas轴对ACE-AngⅡ-AT1轴的拮抗能力,抑制AT1等因素对足细胞的损伤,并改善血液流动学。