论文部分内容阅读
园林植物的花色直接影响其观赏价值。兰花是花卉产业中价值最高的种类之一,其花色的改良在兰花育种工作中一直备受关注。然而,由于兰花生长周期长、自然结实率低等原因,传统的育种周期较长。利用转基因手段进行兰花育种可以弥补传统育种的缺陷,具有较好的发展前景。本研究旨在通过对花色相关基因的克隆与功能鉴定,获得具有育种价值的花色相关基因,用于兰花遗传转化,为通过转基因途径培育花色丰富的兰花新种质资源提供科学依据。本研究利用巢式PCR与PCR的方法从非洲堇与矮牵牛中克隆了花色形成过程中相关酶的基因,并将这些基因构建到植物表达载体上,通过转化模式植物对其进行了功能鉴定,随后进行了兰花转基因育种的初步研究。具体结果如下:1.从非洲堇中克隆出类黄酮3’5’-羟基化酶(flavonoid3’,5’-hydroxylase, F3’5’H)基因。该基因序列全长为1612bp,编码508个氨基酸;包含两个外显子和一个内含子,在894bp与980bp之间有一个长85bp的内含子。在GeneBank上提交该序列,序列登录号为JF261509。2.从矮牵牛中克隆出二羟黄酮还原酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)基因。该基因序列全长为1122bp,编码373个氨基酸,与NCBI上登录号为(AF233639)的矮牵牛(Petunia×hybrida)DFR基因序列相似度为100%。3.从矮牵牛中克隆出查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)基因。该基因序列全长为653bp,编码210个氨基酸,与登录号为(AB543054)的矮牵牛CHI基因序列相似度为100%。4.构建了查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)基因的pCAMBIA1304-senseCHS、pCAMBIA1304-antiCHS表达载体以及F3’5’H基因的pCAMBIA1304-F3’5’H表达载体。将表达载体质粒转化至农杆菌LBA4404菌株中,获得了用于植物转化的工程菌。5.将正义和反义的CHS基因以及正义的F3’5’H基因导入烟草,均可导致烟草中类黄酮含量的变化;转反义CHS基因的烟草中类黄酮总量比野生型对照降低44.5%-76.4%,部分植株花色变浅;转正义CHS基因的烟草中类黄酮总量比野生型对照升高16.2%-31.6%,花色没有变化;转F3’5’H基因的烟草中类黄酮总量比野生型对照升高幅度较小,为4.0%-16.3%,转基因部分植株花瓣变蓝。6.将正义和反义的CHS基因以及正义的F3’5’H基因分别导入5个兰花种类,转化受体经过抗生素筛选,已获得再生类原球茎。