论文部分内容阅读
目的探究N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）对乙醇致肝细胞损伤的保护作用。方法本研究通过建立乙醇致肝细胞损伤的模型结合加入不同剂量NAC预干预,探讨NAC在乙醇致肝细胞损伤中的保护作用及相关机制。实验分成如下五组:（1）Control组:正常对照组;（2）Hurt组:乙醇损伤组;（3）NAC-L组:1mM NAC+乙醇组（4）NAC-M组:2mM NAC+乙醇组（5）NAC-H组:5mM NAC+乙醇组。此外,为探索乙醇是否能造成肝细胞的氧化损伤,在氧化应激指标部分添加过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）组作为阳性对照组。根据不同乙醇浓度干预后细胞的存活率、乙醇脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量以及细胞形态变化情况确定乙醇损伤肝细胞模型的浓度。在干预组中预加入不同剂量NAC处理30min后,再加入建立乙醇致肝细胞损伤模型的乙醇浓度继续培养24h。各组完成以下指标:（1）利用MTT法检测各组细胞的存活率;（2）赖氏法检测天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙氨酸氨基转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）;（3）微量酶标法检测LDH;（4）收集各组细胞上清液,利用Elisa法,根据试剂盒说明书检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）的水平;（5）利用DCFH-DA探针法通过吸光度检测各组细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量;（6）使用WST-8法检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）;（7）使用DTNB法检测细胞中还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量;（8）通过hoechst染色观察细胞凋亡情况;（9）应用Western blot法检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPKs）通路中JNK、P38 MAPK总蛋白表达量及其磷酸化程度。结果（1）经过MTT法检测细胞存活率表明,NAC作用于张氏肝细胞的安全浓度范围为1-8mM。（2）在乙醇致肝细胞损伤的各浓度中,400mM组可以在保证细胞存活率达到75%左右的情况下并且对细胞有明显的损伤反应,故选用乙醇浓度400mM,损伤24h来建立乙醇致肝细胞损伤模型。（3）通过MTT法检测各组细胞的存活率,与乙醇致肝细胞损伤组相比,NAC预干预组可以提高细胞的存活率以及改善细胞形态。（4）NAC预干预可以降低细胞中AST、ALT、LDH的含量（P<0.05）。（5）NAC预干预可以降低各组细胞上清液的TNF-α含量（P<0.05）。（6）NAC预干预可以降低肝细胞中ROS、MDA水平（P<0.05）,提高各组细胞中SOD以及GSH含量（P<0.05）。（7）各组细胞中JNK及P38 MAPK总蛋白量不受各处理因素的影响,但NAC预干预可以降低受损肝细胞的JNK及P38 MAPK磷酸化水平。结论NAC可以拮抗乙醇诱导的肝细胞损伤,这种保护作用可能通过改善肝细胞受损后的酶学指标,调节炎症水平,降低氧化应激损伤以及调节JNK、P38MAPK通路中相关蛋白的激活实现。这些结果可为NAC在酒精性肝病的预防治疗作用的研究提供科学依据。